[發明專利]梅毒心磷脂和特異性抗體IgG免疫印跡試劑盒及其制備

無效

• 申請號: 201110027404.6
• 申請日: 2011-01-25
• 公開（公告）號: CN102081096A
• 公開（公告）日: 2011-06-01
• 發明（設計）人: 張忠英;劉莉莉;林麗蓉;楊天賜
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/571;G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于設有載體板、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測線、對照線，梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對照線處包被人IgG抗體；辣根過氧化物酶標記抗人γ鏈抗體。

2.如權利要求1所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于所述梅毒特異性重組抗原為TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特異性重組抗原。

3.如權利要求1所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于所述載體板采用PVC板。

4.如權利要求1所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)制備梅毒特異性重組抗原

采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒特異性重組抗原；

2)制備心磷脂抗原

豬心肌組織經低溫速凍后風干，研磨成粉狀后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通過硅膠層析柱洗脫，提取純度95％以上的心磷脂抗原；

3)硝酸纖維素膜的點樣

在硝酸纖維素膜總抗體檢測線上包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對照線處包被人IgG抗體，晾干；

4)制備抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體

以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

5)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記

采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記；

6)制備免疫印跡試劑盒

將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對照線處包被人IgG抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人IgG抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒。

5.如權利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟1)、3)、6)中，所述梅毒特異性重組抗原為TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特異性重組抗原。

6.如權利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述甲醇和氯仿，按體積比甲醇∶氯仿為2∶1；

7.如權利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述梅毒特異性重組抗原的濃度為1～4mg/mL；點樣量為1μL/cm，所述的心磷脂抗原的濃度為0.003％～0.03％，點樣量為1μL/cm。

8.如權利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，采用ELISA的方法鑒定McAb效價在1∶10⁷以上。

9.如權利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述辣根過氧化物酶的底物由0.03％(W/V)的過氧化氫和0.07％(W/V)的二氨基聯苯胺組成。