[發明專利]一種利用慢病毒載體生產轉基因水牛的方法

無效

• 申請號: 201110025337.4
• 申請日: 2011-01-24
• 公開（公告）號: CN102174577A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 李湘萍;石德順;孟凡麗;劉慶友;陸鳳花;羅嬋;蔣建榮
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/873;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

技術領域

本發明涉及動物生物技術、具體是一種利用慢病毒載體生產轉基因水牛的方法。

背景技術

水牛是我國南方主要大家畜之一，具有適應性強、耐高溫高濕、抗病力強、耐粗飼、使用年限長等生物學特性，非常適合我國南方農村飼養。開發利用水牛畜種資源，將現有的役用水牛轉化為乳用或乳肉兼用的商品水牛，是水牛畜牧產業發展的趨勢。然而目前水牛的繁殖率很低、種群的生產性能低劣，急需發展和完善一批與家畜遺傳改良密切相關的農業高技術來提高水牛繁殖力和產奶量。利用胚胎工程技術，特別是轉基因動物技術，是培育動物新品種以及培育動物抗病新品種的一條有效技術措施。2002年，人們首次將慢病毒載體法應用到轉基因動物研究，并在豬、牛等多種動物取得了成功。慢病毒載體轉基因具有以下優點：能感染分裂細胞和非分裂細胞；能轉染多種組織，包括早期胚胎細胞；能穩定整合和長期表達外源目的基因；不易誘發宿主免疫反應；可兼容多個啟動子等。這些優點使得慢病毒載體法成為轉基因動物方法學上的一個新的突破。相對于其他物種來說，水牛體細胞和胚胎不易被外源基因感染，基因轉染的效率較低，同時，外源目的基因不易穩定整合和長期表達；這為獲得水牛轉基因胚胎及生產轉基因水牛增加了難度。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種利用慢病毒載體生產轉基因水牛的方法，以適應水牛品種改良的需要。

本發明以如下技術方案解決上述技術問題：一種利用慢病毒載體生產轉基因水牛的方法，包括如下步驟：

1、高滴度慢病毒包裝：采用傳代培養的293T細胞以及3質粒包裝系統和磷酸鈣轉染方法進行慢病毒包裝。轉染前，將293T細胞以1×10⁵cells/mL的密度傳代于經多聚賴氨酸處理的培養皿中，用10％DMEM培養液于體積百分比為5％CO₂的37℃培養箱中培養，生長到70～80％匯合度時備用。轉染前1h，將培養基更換成無血清無雙抗的DMEM。

轉染時，將3個質粒即15μg載體質粒、10μg包膜蛋白質粒pΔ8.9、5μg包裝質粒pVSV-G和125μLCaCL2于試管中混合均勻，補足體積至500μL。將500μL含磷酸氫二鈉、pH值為6.95的轉化液滴加入上述混合液中，室溫靜置30min。將質粒混合液逐滴加到100mm培養皿的293T細胞中，于體積百分比為5％CO₂的37℃培養箱中培養，第二天換正常培養液培養。轉染后48～72h收集病毒。將收集的上清于1500rpm離心10min，0.45μm濾器過濾收集病毒原液。將病毒上清以20000rpm離心力、4℃離心2h，用100μL的PBS重懸得到濃縮慢病毒，-80℃冷凍保存。

病毒滴度的檢測：293T細胞以濃度2×10⁵cells/mL接種于24孔板中，每孔加500μL?DMEM培養液培養過夜。檢測時將4μL病毒液加到500μL含2％FBS的DMEM培養液中混合均勻，換掉原有的培養液。48～72h觀察綠色熒光蛋白表達情況并計數。

2、制作水牛轉基因體細胞：傳代培養4～5代的水牛成纖維細胞用慢病毒原液進行感染。感染細胞時，除用DMEM和10％胎牛血清外，加入0～10μg/ml?polybrene。轉染第2天，換正常培養液繼續培養細胞并傳代3次，在熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白GFP表達情況。

3、制作水牛轉基因嵌合胚胎：采用顯微注射方法將濃縮慢病毒注入到水牛成熟卵母細胞透明帶下或IVF受精卵中。

水牛卵母細胞體外受精后，將慢病毒濃縮液30～70pL注射到水牛IVF受精卵，與顆粒細胞的單層體外共培養7～9天后，在熒光顯微鏡下檢測囊胚GFP表達情況，篩選獲得水牛轉基因嵌合胚胎。

4、轉基因水牛生產：將經受精卵原核注射法生產的轉基因陽性胚胎移植到自然發情或同期處理發情的代孕母牛子宮內中，一頭母牛移植2枚胚胎。2個月后B超觀察妊娠狀況，對妊娠水牛繼續跟蹤觀察10個月。

本發明突出的實質性效果：

采用本發明獲得了高滴度慢病毒粒子，濃縮病毒平均滴度達到10⁹以上。將病毒原液直接感染水牛成纖維細胞，陽性細胞感染率可達30％以上。采用受精卵原核注射法將濃縮病毒注射到水牛成熟卵母細胞透明帶下或IVF受精卵中，24％以上轉基因胚胎發育至囊胚階段，40％以上囊胚表達外源基因。成功獲得一頭轉綠色熒光蛋白GFP基因的轉基因水牛。

附圖說明

圖1是用本發明方法獲得的慢病毒感染的水牛成纖維細胞的可見光圖譜。

圖2是用本發明方法獲得的慢病毒感染的水牛成纖維細胞的紫外光圖譜。