[發明專利]一種利用慢病毒載體生產轉基因水牛的方法

無效

• 申請號: 201110025337.4
• 申請日: 2011-01-24
• 公開（公告）號: CN102174577A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 李湘萍;石德順;孟凡麗;劉慶友;陸鳳花;羅嬋;蔣建榮
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/873;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

1.一種利用慢病毒載體生產轉基因水牛的方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

(1)高滴度慢病毒包裝：采用傳代培養的293T細胞以及3質粒包裝系統和磷酸鈣轉染方法進行慢病毒包裝，轉染時，將3個質粒即15μg載體質粒、10μg包膜蛋白質粒pΔ8.9、5μg包裝質粒pVSV-G和125μLCaCL2于試管中混合均勻，補足體積至500μL，將500μL含磷酸氫二鈉、pH值為6.95的TS轉化液滴加入上述混合液中，室溫靜置30min，將質粒混合液逐滴加到293T細胞中，于體積百分比為5％CO₂的37℃培養箱中培養，第二天換培養液，轉染后48～72h收集病毒，將收集的上清1500rpm離心10min，0.45μm濾器過濾收集病毒原液，將病毒上清以20000rpm離心力、4℃離心2h，用100μL的PBS重懸得到濃縮慢病毒、分裝，-80℃冷凍保存，濃縮后病毒滴度達1×10⁹IU以上，

(2)制作水牛轉基因體細胞：傳代培養4～5代的水牛成纖維細胞用慢病毒原液進行感染，細胞轉染時，除DMEM和10％胎牛血清外，加入0～10μg/mlpolybrene，轉染第2天，換正常培養液繼續培養細胞并傳代3次，在熒光顯微鏡下檢測細胞的綠色熒光蛋白GFP表達情況，獲得感染率達30％以上的轉基因體細胞，

(3)制作水牛轉基因嵌合胚胎：水牛卵母細胞體外受精后，將慢病毒濃縮液30～70pL注射到水牛IVF受精卵中，與顆粒細胞的單層細胞體外共培養7～9天后，在熒光顯微鏡下檢測囊胚GFP表達情況，篩選獲得水牛轉基因嵌合胚胎，24％以上轉基因胚胎發育至囊胚階段，40％以上囊胚表達外源基因，

(4)轉基因水牛生產：將經受精卵原核注射法生產的轉基因陽性胚胎移植到自然發情或同期處理發情的代孕母牛子宮內中，一頭母牛移植2枚胚胎，2個月后B超觀察妊娠狀況，對妊娠水牛繼續跟蹤觀察10個月。