[發明專利]一種克隆山羊TNNC2基因編碼區全序列的方法

有效

• 申請號: 201110024891.0
• 申請日: 2011-01-24
• 公開（公告）號: CN102146372A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 陳浩林;徐剛毅;汪代華;徐洪剛
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是一種克隆山羊骨骼肌肌鈣蛋白C2(TNNC2)基因編碼區全序列的方法。

背景技術

快肌肌鈣蛋白C2(TNNC2)是存在于骨骼肌細肌絲中的鈣離子結合蛋白復合物成員之一。肌鈣蛋白C與肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I一起形成三元肌鈣蛋白復合物，在肌肉的收縮和舒張中起著關鍵作用。肌鈣蛋白C2是快速骨骼肌收縮的鈣離子受體，并且是鈣離子激活肌小節收縮的關鍵。鈣離子的結合啟動了細肌絲褶皺般的結構的變化通過細肌絲組成蛋白。導致肌球蛋白和肌動蛋白間的橫橋的變形，促使細肌絲向粗肌絲的滑動產生肌肉收縮的效果。

快肌肌鈣蛋白C2含有4個鈣離子結合位點，是肌鈣蛋白復合物中的一個重要成員。每個鈣離子結合位點均有一個由12個氨基酸殘基組成的鈣離子結合環，鈣離子結合環存在于一對a-螺旋中。每個鈣離子結合環都富含酸性氨基酸(Asp?and?Glu)負責結合單個鈣離子。TNNC2整體結構包括一個N-末端和一個C-末端的球形區域，這兩個球形區域被一個靈活的螺旋鏈接。從而形成啞鈴形。每個球形區域包含一對EF手性結構域用于結合金屬離子。

RT-PCR克隆：是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)以及分子克隆相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細胞基因中，然后用質粒PCR產物測序。此技術利用PCR技術能在體外進行有效的基因擴增，而不需要內切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術很快獲得其他依靠限制性內切酶消化的方法難于得到的PCR產物；克隆載體PCR測序能克服PCR產物測序引物近端的十幾個堿基無法測序獲得的缺點。與RACE(cNDA末端快速擴增)技術相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本低，工作量小。該技術成功的關鍵是PCR引物的設計，在起始密碼子的上游設計上游引物，在終止密碼子的下游設計下游引物，使得PCR產物包含完整的基因編碼區全序列。

現有技術中采用RACE(cNDA末端快速擴增)技術：是基于PCR技術基礎上由已知的一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴增從而獲得完整的3’端和5’端的方法。1、目的PCR產物的基因片段長度不明確。2、試驗成本高。3、工作量大，實驗技術要求高。

分段PCR克隆法：將目的基因分成幾段來分別克隆，然后做亞克隆測序拼接。成本高，工作量大，一個基因分成幾段就需要做幾次克隆。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種簡單、快捷的獲取山羊TNNC2基因的完整編碼區序列的方法，填補了該基因在山羊上的空白，為進一步研究山羊的該基因奠定了基礎。

本發明采用以下技術方案：

一種克隆山羊TNNC2基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟：

A1、提取山羊眼肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；

A2、引物的設計及PCR反應：設計一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區域設計，下游引物在終止密碼子的下游區域設計；設計的引物為：

上游引物P1：5′-TGATGACGGACCAGCAGG-3′

下游引物P2：5′-CTTCTTACTGCACGCCCTC-3′

用cDNA為模板進行梯度PCR操作擴增TNNC2基因，溫度為范圍在50℃到65℃之間的8個溫度點.PCR反應體系為10ul體系(5μL的2×Master?Mix?Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH₂O.)，反應條件為95℃預變性5min，35個循環(94℃，40s；50℃～60℃，40s；72℃，50s)，最后72℃10min。

A3、PCR產物的回收和純化；

A4、克隆。

所述的方法，所述步驟A1包括以下步驟：用液氮將眼肌磨成粉末裝入1.5ml的EP管，放入零下80的超低溫冰箱中備用；取新的1.5ml的EP管，加入1.3ml的Trizol液，然后加入約80mg的眼肌組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘；4℃下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉運到另一個新的1.5ml的EP管，加入0.2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；取上層水相0.4ml于一新的離心管，加入0.4ml的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入1ml的75％乙醇混勻，4℃下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，加入30到100UL的DEPC水；將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。