[發明專利]一種克隆山羊TNNC2基因編碼區全序列的方法

有效

• 申請號: 201110024891.0
• 申請日: 2011-01-24
• 公開（公告）號: CN102146372A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 陳浩林;徐剛毅;汪代華;徐洪剛
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種克隆山羊TNNC2基因編碼區全序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A1、提取山羊眼肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；

A2、引物的設計及PCR反應：設計一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區域設計，下游引物在終止密碼子的下游區域設計；設計的引物為：

上游引物P?1：5′-TGATGACGGACCAGCAGG-3′

下游引物P2：5′-CTTCTTACTGCACGCCCTC-3′

用cDNA為模板進行梯度PCR操作擴增TNNC2基因，溫度為范圍在50℃到65℃之間的8個溫度點.PCR反應體系為10ul體系(5μL的2×Master?Mix?Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH₂O.)，反應條件為95℃預變性5min，35個循環(94℃，40s；50℃～60℃，40s；72℃，50s)，最后72℃10min。

A3、PCR產物的回收和純化；

A4、克隆。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A1包括以下步驟：用液氮將眼肌磨成粉末裝入1.5ml的EP管，放入零下80的超低溫冰箱中備用；取新的1.5ml的EP管，加入1.3ml的Trizol液，然后加入約80mg的眼肌組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘；4℃下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉運到另一個新的1.5ml的EP管，加入0.2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；取上層水相0.4ml于一新的離心管，加入0.4ml的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入1ml的75％乙醇混勻，4℃下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，加入30UL到100UL的DEPC水；將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。