[發明專利]一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽的高效表達及其應用

無效

• 申請號: 201110009913.6
• 申請日: 2011-01-18
• 公開（公告）號: CN102167734A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 劉忠淵;張富春;唐馨
• 申請（專利權）人: 新疆大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/17;A61P31/00;A23K1/17;A23L3/3535
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發明領域

本發明涉及微生物次生物質代謝技術領域。具體的說，本發明涉及一種高效表達重組突變的黃粉蟲抗菌肽及其高效表達的應用。

背景技術

抗菌肽廣泛存在于各種有機體內，包括細菌、昆蟲、植物和脊椎動物，已經從多種生物體內分離得到抗菌肽，它們具有廣譜抗菌活性，可以保護機體抵御細菌、病毒、真菌和一些寄生物的侵染，是生物體內先天性防御系統的重要組成成分。目前越來越多的細菌對傳統抗生素產生了耐藥性，尤其是超級細菌的出現，新型抗生素的研發速度相對較慢，對付超級細菌已經成為現代醫學面臨的一個難題。與傳統抗生素作用機理不同，抗菌肽通過破壞質膜結構達到抑殺細菌的作用，是目前抗病原微生物藥物開發研究中的熱點，有望成為新一代的抗菌制劑。

近年來，對昆蟲抗菌肽的研究已成為一個迅速發展的新領域，越來越引起人們的關注和重視。黃粉蟲(Tenebrio?molitor)其幼蟲別名面包蟲，既是一種生理、遺傳學實驗材料，又為極具開發潛力的重要資源昆蟲。雖然黃粉蟲在我國分布廣，資源豐富，但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005％)，成本高未能實現工業化生產。隨著現代生物技術的發展，獲得黃粉蟲抗菌肽基因的高效表達，為黃粉蟲抗菌肽的研究和開發具有重要的意義。

發明內容

針對現有技術天然抗菌肽含量少，提取得率低，重組抗菌肽的表達量不高的現狀，本發明旨在提供一種高表達的突變黃粉蟲抗菌肽的基因序列和編碼多肽序列，以應用于黃粉蟲抗菌肽的大量制備中。

本發明的技術方案：根據GenBank中的黃粉蟲抗菌肽基因tenecin?1設計特異性引物，從黃粉蟲的3齡幼蟲中克隆到黃粉蟲抗菌肽的tenecin?1?cDNA分子，所編碼的蛋白質富含半胱氨酸；擴增獲得tenecin?1?cDNA分子的開放閱讀框是255bp，為了獲得黃粉蟲抗菌肽的原核高效表達，本發明設計了特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分核酸序列，同時獲得帶有更多正電荷的抗菌肽，以利其高抗菌活性的發揮，將成熟肽部分N端的兩個谷氨酸突變成兩個精氨酸；從而獲得本發明用于原核細胞高效表達并具有高活性的抗菌肽基因195bp，命名為TmAMP1m。將突變的黃粉蟲抗菌肽基因TmAMP1m?195bp亞克隆至原核表達載體，轉化大腸桿菌，獲得了突變的黃粉蟲抗菌肽基因的高效表達，抑菌實驗證明所表達的黃粉蟲抗菌肽具有明顯的抑菌活性，為黃粉蟲抗菌肽的大量制備奠定了基礎。

具體的，本發明提供了一種突變的黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列，全長為195bp，其編碼由序列表中序列表SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列中65個氨基酸組成的蛋白質，獲得的重組黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。

同時，本發明提供了一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽的獲得方法，具體包括如下步驟：

1.黃粉蟲總RNA的提取和反轉錄合成cDNA。

取大約3齡的黃粉蟲幼蟲，放入無RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA；A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測；以總RNA為模板，Oligo?dT為引物，使用反轉錄酶M-MLV(RNase?H-)，反轉錄合成eDNA。

2.PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因(tenecin?1)。

以上述合成的cDNA為模板，設計上、下游引物，引入限制性內切酶BamHI和XhoI位點，PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因tenecin?1；在1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測PCR結果，回收PCR產物，連接T載體；進行測序分析，鑒定獲得了正確的tenecin?1。

3.突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的PCR擴增。

設計了特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分基因，將成熟肽部分N端的兩個谷氨酸突變成兩個精氨酸；從而獲得本發明用于原核細胞高效表達并具有高活性的抗菌肽基因195bp，命名為TmAMP1m。獲得突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的流程圖見圖1。

4.原核表達載體的構建及表達。

將回收的PCR產物TmAMP1m基因與表達載體pET30a分別進行雙酶切，對雙酶切的TmAMP1m，pET30a進行過夜連接，獲得pET30a-TmAMP1m重組質粒。pET30a-TmAMP1m轉化感受態細胞E.coli?DH5α，篩選陽性克隆，陽性克隆大量培養并提取質粒。將提取的質粒pET30a-TmAMP1m轉化感受態細胞E.coli?BL21，卡那霉素篩選獲得陽性克隆。將含重組質粒的陽性克隆在37℃培養，加入IPTG誘導獲得可溶性、突變的黃粉蟲抗菌肽。