[發明專利]一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽的高效表達及其應用

無效

• 申請號: 201110009913.6
• 申請日: 2011-01-18
• 公開（公告）號: CN102167734A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 劉忠淵;張富春;唐馨
• 申請（專利權）人: 新疆大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/17;A61P31/00;A23K1/17;A23L3/3535
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1.一種突變的黃粉蟲抗菌肽，其特征在于，所述的一種突變的黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列，全長為195bp，其編碼由序列表中序列表SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列中65個氨基酸組成的蛋白質，獲得的重組黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。

2.一種如權利要求1所述的突變的黃粉蟲抗菌肽的獲得方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

(1)黃粉蟲總RNA的提取和反轉錄合成cDNA：取大約3齡的黃粉蟲幼蟲，放入無RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA；A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測；以總RNA為模板，Oligo?dT為引物，使用反轉錄酶M-MLV(RNase?H-)，反轉錄合成eDNA；

(2)PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因(tenecin?1)：以步驟1合成的cDNA為模板，設計上、下游引物，引入限制性內切酶BamHI和XhoI位點，PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因tenecin?1；在1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測PCR結果，回收PCR產物，連接T載體；進行測序分析，鑒定獲得了正確的tenecin?1；

(3)突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的PCR擴增：設計了特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分基因，將成熟肽部分N端的兩個谷氨酸突變成兩個精氨酸；從而獲得用于原核細胞高效表達并具有高活性的抗菌肽基因195bp，命名為TmAMP1m；

(4)原核表達載體的構建及表達：將回收的PCR產物TmAMP1m基因與表達載體pET30a分別進行雙酶切，對雙酶切的TmAMP1m，pET30a進行過夜連接，獲得pET30a-TmAMP1m重組質粒；pET30a-TmAMP1m轉化感受態細胞E.coli?DH5α，篩選陽性克隆，陽性克隆大量培養并提取質粒；將提取的質粒pET30a-TmAMP1m轉化感受態細胞E.coli?BL21，卡那霉素篩選獲得陽性克?。粚⒑亟M質粒的陽性克隆在37℃培養，加入IPTG誘導獲得可溶性、突變的黃粉蟲抗菌肽。

3.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在殺滅氨芐青霉素的大腸桿菌中的應用，其特征在于，所述的其殺滅氨芐青霉素的大腸桿菌的抑菌濃度(MIC)為0.020-0.011μg/ml。

4.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在殺滅卡那霉素抗性的大腸桿菌中的應用，其特征在于，所述的其殺滅卡那霉素抗性的大腸桿菌的抑菌濃度(MIC)為0.022-0.013μg/ml。

5.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備治療病原微生物感染的抗菌藥物中的應用。

6.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備耐藥菌的抗菌藥物中的應用。

7.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備飼料添加劑中的應用。

8.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備保鮮劑中的應用。