[發明專利]高抗草甘膦特變基因及其改良方法和應用

有效

• 申請號: 201110009329.0
• 申請日: 2011-01-17
• 公開（公告）號: CN102146371A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 沈志成;林朝陽;徐曉麗;李新蘭
• 申請（專利權）人: 杭州瑞豐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/29;C12N15/63;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體的說，本發明涉及一種改良抗草甘膦基因的方法、抗草甘膦基因及其編碼的蛋白質，以及利用這些改良的抗草甘膦基因獲得轉基因抗草甘膦植物的方法。本發明可以運用在作物的育種、也可以運用在植物細胞培養的篩選。

背景技術

草甘膦是一種非常重要的除草劑，它是抑制植物中芳香族氨基酸生物合成中的一種重要的酶，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）。草甘膦是一種極廣譜的除草劑，對農作物也同樣具備殺傷力。因此為了能夠在農作物生長時選擇性地除草，農作物需要獲得具有抗草甘膦的能力。

草甘膦能夠抑制大部分細菌中芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）。但部分細菌的EPSPS已發現對草甘膦具有抗性，并且被分離獲得。植物可以通過轉基因表達細菌的抗性EPSPS而獲得抗草甘膦的能力。農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens?sp?CP4)和?Salmonella?typhimurium?CT7的EPSPS在植物中表達而獲得的抗性已在生產中應用（?美國專利453590，4769061，5094945）。但是為了提高轉基因農作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產應用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此為基礎的轉基因抗草甘膦植物。

從Deinococcus?radiodurans?R1獲得的EPSPS基因具有相當的抗草甘膦能力（中國專利200910098129.X）。2009年申請的申請號200910098129.X的發明專利《一種抗草甘膦基因及其應用》提供了抗草甘膦基因，其中基因G1174所編碼的蛋白質的氨基酸序列如該專利的SEQ?ID?NO：2所示。盡管D.?radiodurans?R1的EPSPS的抗草甘膦能力比較高，但是獲得抗性更高的EPSPS改良基因仍然十分必要。提供轉基因植物的抗性水平能夠提高草甘膦的使用劑量，從而可以減緩抗性雜草的發生，避免使用過程中由于劑量問題而造成藥害。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種改良抗草甘膦EPSPS基因的方法和提供一種抗草甘膦基因。這種抗性基因具有比D.?radiodurans?R1天然的EPSPS基因更高的抗草甘膦能力。利用這種基因可以用來產生轉基因抗草甘膦植物，也可作為植物細胞培育中的篩選標記。

為了解決上述技術問題，本發明是通過這樣的技術方案來實現的：本發明提供一種通過特變獲得高抗草甘膦的G1174特變基因（高抗草甘膦特變基因）的方法，在第95到114位的氨基酸序列?(Pro?Gly?Asn?Ala?Gly?Ala?Val?Ala?Arg?Phe?Leu?Met?Gly?Val?Ala?Ala?Leu?Thr?Ser?Gly)中引入2個或者2個以上的氨基酸特變，然后選擇高抗草甘膦的突變體。特別是引入2個或者2個以上如下位點的特變：1）第99號甘氨酸；2)第100號丙氨酸；3）第104號苯丙氨酸；4）第106號甲硫氨酸；5）第107號甘氨酸。

本發明同時也提供一種G1174抗草甘膦特變基因（高抗草甘膦特變基因），其編碼的蛋白質包括至少2個以下位點的特變：1）第99號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸；2)第100號氨基酸從丙氨酸特變成為苯丙氨酸，或者蘇氨酸，或者甲硫氨酸，或者絲氨酸；3）第104號氨基酸從苯丙氨酸特變成為亮氨酸或者絲氨酸；4）第106號氨基酸從甲硫氨酸特變成為亮氨酸或者絲氨酸；5）第107號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸。

本發明進一步提供一種抗草甘膦G1174的特變基因（高抗草甘膦特變基因），其編碼的蛋白質的第95到114位的氨基酸序列特變成為如下的任何一種：?1）SEQ?ID?NO：4；?2）SEQ?ID?NO：5；?3）SEQ?ID?NO：6；?4）SEQ?ID?NO：7；?5）SEQ?ID?NO：8；?6）SEQ?ID?NO：9；?7）SEQ?ID?NO:10;?8）SEQ?ID?NO：11;?9）SEQ?ID?NO：12;?10）SEQ?ID?NO：13;?11）SEQ?ID?NO：14;?12）SEQ?ID?NO：15;?13）SEQ?ID?NO：16,??14）SEQ?ID?NO：17，?15）SEQ?ID?NO：18，16）SEQ?ID?NO：19，?17)SEQ?ID?NO：20，?18)SEQ?ID?NO：21，?19)SEQ?ID?NO：22，?20)SEQ?ID?NO：23，?21)?SEQ?ID?NO：24。