[發(fā)明專利]一種快速簡(jiǎn)便的基因克隆方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110009139.9
• 申請(qǐng)日: 2011-01-17
• 公開（公告）號(hào): CN102174511A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龍加福;周浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/09
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速簡(jiǎn)便的基因克隆方法，適合于從基因組DNA，cDNA文庫(kù)和含有基因的載體上通過(guò)PCR方法克隆基因到目的載體上，屬于基因工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

基因克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段與能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或受體生物進(jìn)行進(jìn)一步研究的分子操作的過(guò)程，又稱DNA克隆，分子克隆，基因操作或重組DNA技術(shù)。基因克隆主要包括目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導(dǎo)入宿主細(xì)胞和重組子的篩選。

目前PCR產(chǎn)物的克隆方法主要有粘性末端克隆，平末端克隆和T-末端克隆。在獲得PCR產(chǎn)物和選擇好目的載體之后，通常的方法都是用限制性內(nèi)切酶同時(shí)酶切PCR產(chǎn)物和目的載體，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和膠回收試劑盒分離純化酶切好的PCR產(chǎn)物和載體，進(jìn)而繼續(xù)后面的連接，轉(zhuǎn)化和篩選等步驟。整個(gè)基因克隆的過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，然而現(xiàn)在一些公司推出了商業(yè)化的快速限制性內(nèi)切酶和快速DNA連接酶以后，使酶切和連接的時(shí)間都能縮短到十分鐘左右的時(shí)間完成，這時(shí)瓊脂糖凝膠電泳和膠回收就成為基因克隆耗時(shí)最長(zhǎng)的步驟了。

另外，目前最方便快捷的基因克隆方法是A-T克隆法。商業(yè)化的T載體是能較快的用于克隆基因，但是采用T載體克隆一方面增加了基因克隆的步驟，還需要進(jìn)一步把目的DNA片段克隆到目的載體上，增加了整個(gè)基因克隆的步驟和時(shí)間；另一方面不僅增加了成本，而且不適合于用單一的具有3’～5’校正酶活性的DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有基因克隆過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)的問(wèn)題，提供一種快速簡(jiǎn)便的基因克隆方法。

本發(fā)明提供的快速簡(jiǎn)便的基因克隆方法首先利用快速限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)酶切目的DNA（PCR產(chǎn)物）和載體DNA，酶切體系如下：

載體（或PCR產(chǎn)物）???????5～20ng（或5-20ul）

10×酶切緩沖液????????????2.5μl

內(nèi)切酶1??????????????????1.5μl

內(nèi)切酶2??????????????????1.5μl

雙蒸水??????????????補(bǔ)足至25μl

然后利用苯酚和氯仿抽提、乙醇和醋酸鈉沉淀DNA的方法來(lái)回收酶切的DNA片段，其抽提沉淀體系如下：

載體酶切產(chǎn)物抽提上清?????????????20μl（依據(jù)上面的酶切體系大小而定）

基因片段酶切產(chǎn)物抽提上清?????????20μl（依據(jù)上面的酶切體系大小而定）

乙酸鈉????????????????????????????4μl（1/10上清總體積）

冷乙醇???????????????????????????80μl（2倍上清總體積）

進(jìn)而離心沉淀得到目的DNA和載體DNA酶切產(chǎn)物的混合物，室溫干燥后進(jìn)行連接，其連接體系如下：

沉淀?????????????????????0μl

5×連接緩沖液????????????2.0μl

連接酶???????????????????0.5μl

雙蒸水??????????????補(bǔ)足至10μl

最后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，第二天用菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆。

本發(fā)明方法的具體操作步驟如下：

第1、通過(guò)PCR獲得目的DNA片段并選擇好目的載體；

第2、取載體DNA和PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行快速的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，酶切完成后分別加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液，然后渦旋混勻進(jìn)行抽提；

第3、將第2步抽提得到的上清取出置于一個(gè)新的離心管中混合，再加入pH5.2的乙酸鈉和冷乙醇沉淀酶切后的DNA，混勻后置于-20℃或者-70℃放置半個(gè)小時(shí)，然后離心去上清，于室溫晾干DNA沉淀，加入適量的去離子水溶解DNA，再加入連接緩沖液和DNA連接酶，然后繼續(xù)后面的連接、轉(zhuǎn)化和篩選等步驟。

本發(fā)明方法可用于各種基因克隆或者亞克隆實(shí)驗(yàn)的中間步驟。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

本發(fā)明是利用生物化學(xué)的方法，找到了一種替換瓊脂糖凝膠電泳和膠回收分離純化DNA片段的方法，簡(jiǎn)化了基因克隆的步驟，使整個(gè)基因克隆的過(guò)程更加簡(jiǎn)便快速。在本發(fā)明中，不需要對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，而是采用抽提沉淀DNA的方法。