[發明專利]一種快速簡便的基因克隆方法

無效

• 申請號: 201110009139.9
• 申請日: 2011-01-17
• 公開（公告）號: CN102174511A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 龍加福;周浩
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/09
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

1.一種快速簡便的基因克隆方法，其特征在于首先利用快速限制性內切酶系統酶切載體DNA或目的DNA，酶切體系如下：

載體或目的DNA???????????5～20ng或5～20ul

10×酶切緩沖液????????????2.5μl

內切酶1??????????????????1.5μl

內切酶2??????????????????1.5μl

雙蒸水??????????????補足至25μl

然后利用苯酚和氯仿抽提、乙醇和醋酸鈉沉淀DNA的方法來回收酶切的DNA片段，其抽提沉淀體系如下：

載體酶切產物抽提上清?????????????20μl

基因片段酶切產物抽提上清?????????20μl

乙酸鈉????????????????????????????4μl

冷乙醇???????????????????????????80μl

進而離心沉淀得到目的DNA和載體DNA酶切產物的混合物，室溫干燥后進行連接，其連接體系如下：

沉淀?????????????????????0μl

5×連接緩沖液????????????2.0μl

連接酶???????????????????0.5μl

雙蒸水??????????????補足至10μl

最后，連接產物轉化大腸桿菌，第二天用菌落PCR方法篩選陽性克隆。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下：

第1、通過PCR獲得目的DNA片段并選擇好目的載體；

第2、取載體DNA和PCR產物分別進行快速的限制性內切酶反應，酶切完成后分別加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液，然后渦旋混勻進行抽提；

第3、將第2步抽提得到的上清取出置于一個新的離心管中混合，再加入pH5.2的乙酸鈉和冷乙醇沉淀酶切后的DNA，混勻后置于-20℃或者-70℃放置半個小時，然后離心去上清，于室溫晾干DNA沉淀，加入適量的去離子水溶解DNA，再加入連接緩沖液和DNA連接酶，然后繼續后面的連接、轉化和篩選步驟。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于該方法用于各種基因克隆或者亞克隆實驗的中間步驟。