[發明專利]一種人血小板源性生長因子A同源二聚體及其生成方法

無效

• 申請號: 201110009024.X
• 申請日: 2011-01-17
• 公開（公告）號: CN102154305A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 吳東海;李洪波;金守光;徐愛民;李侍武
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/49;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;胡杰

1.一種生產人血小板源性生長因子A同源二聚體的方法，其特征在于：主要包括以下步驟：

(1)克隆人PDGF-A基因：以人血小板細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整人重組PDGF-A基因片段，所用PDGF-A特異引物中引入Xho?I酶切位點和在未端引入Xba?I酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，得質粒rhPDGF-A/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；

(2)構建真核表達載體：將表達載體pPICZαA和質粒rhPDGF-A/pMD20-T經過Xho?I及Xba?I雙酶切并純化回收，并利用T4DNA連接酶連接，得重組載體pPICZαA/PDGF-A；

(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中：重組載體pPICZαA/PDGF-A用SacI單酶切線性化后，用電擊轉化法轉入畢赤酵母GS-115宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆；

(4)高水平分泌表達酵母轉化子的篩選：陽性克隆轉接至含有500μg/mL?Zeocin的YPD平板，篩選到了Zeocin抗性的轉化子；將所述Zeocin抗性的轉化子利用YPD液體培養基洗下，經稀釋后，涂布到2000μg/mL?Zeocin的YPD平板，得到高抗性轉化子，再以BMGY培養基培養至光密度值＞10.0，離心收集細胞，用BMMY培養基重懸細胞并使其甲醇濃度為1.0％，誘導120小時后，經SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表達rhPDGF-AA酵母轉化子；

(5)誘導后的酵母轉化子上清液離心，收集離心后的上清液，20mM?Tris?pH?8.0透析后，利用CM陽離子交換柱于ATKA-HPLC系統中純化，0.13MNaCl的20mM?Tris?pH?8.0緩沖液漂洗后，利用PBS洗脫收集的樣品，利用超濾法濃縮收集到的蛋白，濃縮樣品經分子篩分離，收集OD₂₈₀＞50mAU的樣品；收集的樣品利用超濾方法濃縮，濃縮樣品經分子篩分離，收集PDGF-AA目標蛋白，最后得到純度達97％以上的重組人PDGF-AA蛋白。

2.根據權利要求1所述的生產方法，其特征是：步驟(1)中所述PDGF-A特異引物為：

5’-GCCTCGAGAAGAGAAGCATCGAGGAAGCT-G3’

5’-GCTCTAGATCACCTCACATCCGTGTC-3’。

3.根據權利要求1或2所述方法生產得到的人血小板源性生長因子A同源二聚體，該同源二聚體中一條PDGF-A鏈經糖基化修飾，另一條鏈未經糖基化修飾；所述同源二聚體的分子量27825.513Da。