[發明專利]檢測硫醇的方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201110008841.3
• 申請日: 2011-01-11
• 公開（公告）號: CN102183471A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 霍方俊;陰彩霞;孫遠強;張建剛
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: G01N21/27
• 分類號: G01N21/27;G01N21/29
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術領域

本發明涉及硫醇檢測分析技術，具體屬于一種快速、定量地檢測硫醇的方法，以及檢測硫醇的試劑盒。

背景技術

硫醇在生物體系中起著關鍵作用。三種結構相似的小分子硫醇：半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在維持生物系統中扮演著至關緊要的的角色。細胞內硫醇濃度的改變與一些疾病緊密相連，如白血球降低、牛皮癬、肝臟損傷、癌癥和艾滋病。半胱氨酸(Cys)缺乏會引起很多綜合疾病，如兒童生長緩慢、白化病、水腫、嗜睡癥、肝臟損傷、肌肉和脂肪消損、皮膚損傷、虛弱。血漿中高水平的同型半胱氨酸(Hcy)是Alzheimer癥、葉酸和維生素B₁₂缺乏癥和心血管疾病的致病因素之一。血漿中總的同型半胱氨酸(tHcy)濃度與出生缺陷、老年癡呆等疾病有關。谷胱甘肽(GSH)是細胞內含量最高的非蛋白質硫醇(1～10mmol/L)，支持許多細胞功能，如維持細胞氧化還原動態平衡、異型生物質的新陳代謝、細胞內的信號傳導以及基因調節。更為重要的是，谷胱甘肽能保持蛋白質中半胱氨酸巰基處于還原態，和通過俘獲傷害DNA和RNA的自由基保護細胞免受氧化傷害。因此，定量檢測生物體系中硫醇的濃度在科研和臨床中具有重要意義，建立快速、準確、靈敏的硫醇檢測方法，也是預防和監測硫醇所引發的疾病的重要措施之一。

目前已報道的用于檢測硫醇的檢測方法有：高效液相色譜法、毛細管電泳法、電化學法、傅里葉變換紅外光譜、質譜法等。然而這些方法檢測過程需要大型儀器、檢測過程繁瑣、耗時、設備和藥品比較昂貴等。小型醫院及診所由于缺乏大型設備，而無法把測定病人體液中硫醇的含量作為臨床上的一個常規檢驗。所以，發展一種檢測過程簡單、靈敏、成本低、適合臨床、科研使用的的檢測硫醇的方法非常必要。

發明內容：

本發明的目的是為了克服現有技術硫醇檢測中存在的問題，提供一種體系簡單、操作方便、選擇性高、靈敏度高的硫醇定量檢測方法，并提供一種價格便宜、操作簡單、檢測過程迅速的硫醇檢測試劑盒。

本發明提供的檢測硫醇的方法和試劑盒，是基于一種色烯衍生物NPC，7-nitro-2，3-dihydro-1H-cyclopenta[b]chromen-1-one(F.J.Huo，C.X.Yin，P.Yang.ActaCryst.2004，E60，o2087-o2089)，在HEPES緩沖溶液中定量地檢測硫醇。所述的硫醇為半光氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。

本發明的技術方案是：

一種檢測硫醇的方法(光譜法檢測)，包括如下步驟：

(1)、配制pH＝7.0-10.0、濃度為1-100mM的HEPES緩沖溶液，配制濃度為2mM的NPC乙醇溶液；

(2)、把2ml的HEPES緩沖溶液和25μl的NPC溶液加到干凈的紫外比色皿中，在紫外可見分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，最大吸收峰由292nm逐漸變為405nm，當405nm吸收峰達到最大值時，停止加待測樣，此時加入待測樣的體積計為V_待測樣μl；

(4)、按25×2×10^-3/V_待測樣計算出待測樣中硫醇的含量。

另一種檢測硫醇的方法(比色法)，包括如下步驟：

(1)、配制pH＝7.0、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，標記為R₁，配制濃度為2mM的NPC乙醇溶液，標記為R₂；

(2)、按照R₁、R₂體積比為100∶1，加入比色管中，此時溶液為無色；

(3)、取R₂體積1/5的待測樣，用進樣器加到上述比色管中，搖振20-30s后，與標準色階進行對照，得出待測樣中硫醇濃度范圍；

標準色階的制定：在含有100μM的NPC、pH＝7.0且濃度為10mM的HEPES緩沖溶液中，依次向六個比色管中分別加入硫醇溶液，使硫醇的濃度分別為0、15、30、50、80、100μM，得到標準的色階(見圖4)，即：從左到右的顏色依次為，無色、淡黃色、淺黃色、黃色、亮黃色、深黃，代表相應的硫醇濃度為：0、15、30、50、80、100μM。

本發明提供的一種檢測硫醇的試劑盒，包括試劑瓶1、試劑瓶2、比色管、標準色階；

所述的試劑瓶1裝有100mL濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，標記為試劑R₁；