[發明專利]用于校正檢測器間頻帶增寬效應的方法

有效

• 申請號: 201110008100.5
• 申請日: 2004-08-06
• 公開（公告）號: CN102183607A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: S·P·特拉伊諾夫
• 申請（專利權）人: 懷雅特技術公司
• 主分類號: G01N30/86
• 分類號: G01N30/86;G01N30/74
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民

本申請是2004年8月6日提交的名稱為：“用于校正檢測器間頻帶增寬效應的方法”的中國專利申請2004100626736的分案申請。

技術領域

本發明涉及用于校正頻帶增寬效應的方法，尤其涉及用于校正檢測器間頻帶增寬效應的方法。

背景技術

用液相色譜技術對溶液中的大分子物質進行分析，通常是通過在適當的溶劑中制備樣品，然后將它的小等份注射進入色譜儀來完成的。該色譜儀包括各種類型的分級器件，它們在樣品經過它們時將其分離。一旦通過這些通常是基于尺寸、質量或柱親和力的方法將樣品分離后，便用光散射、折光指數、紫外線(UV)、粘度響應等方法對其進行分析。例如，為了確定通過尺寸排阻色譜柱進行分離的特定樣品的質量和尺寸分布，色譜儀將先后用多角度光散射MALS和差動式折射計(differential?refractometer)dRI測量樣品。dRI確定濃度，而MALS儀器測定超瑞利比(excess?Rayleigh?ratio)，將它作為每個洗脫級分的角度函數。對于比入射光波長小得多的分子，通常在一個單一的角度上進行光散射測量就足夠了。

當各個級分經過檢測器時，便產生了通常稱之為“頻帶(band)”或者“波峰(peak)”的信號。由于擴散和混合效應，樣品每次穿過不同的器件時，這些頻帶便會增寬一些。考慮由單分散性蛋白的低濃度等分樣品。在這種情況下，瑞利逾量比與摩爾質量和濃度成正比。光散射信號和濃度信號應該具有相同的形狀，并且當這兩種響應被歸一化而具有相等面積時，它們將完全重疊。然而，當樣品從MALS檢測器經過而進入dRI檢測器時，它要經過中間區域和連接部位，這會導致樣品的擴散和混合。由John?Wiley?&?Sons于1979年出版的Yau等人所著的《Modern?size?exclusion?liquid?chromatography》一書中詳細討論了頻帶增寬的許多因素和一些與其有關的補救措施。在上述例子中，dRI信號與MALS信號相比，總是顯得略寬。

圖1清楚地顯示了增寬效應，該圖表示了水緩沖液中的牛血清蛋白BSA樣品的色譜圖以及未校準增寬效應的計算出的摩爾質量。跡線1示出沒有校準的摩爾質量。該摩爾質量是用除以單體的摩爾質量M_w0后的結果表示，因此對于單體，縱軸上的讀數為1，二聚體的讀數為2，等等。跡線2反映作為時間函數的90°光散射信號。跡線3反映dRI信號。聚集狀態已經被分級，于是，最右邊從16分鐘到18分鐘的波峰區域是來自純單體的數據，從14分鐘到16分鐘的波峰區域來自二聚體，等等。在每個波峰中，增寬導致波峰中心處的濃度降低，而在“兩翼”處的濃度增高。將此變寬的dRI信號和MALS信號結合起來確定各個洗脫時間處的摩爾質量，導致了在波峰中心附近確定的摩爾質量被系統地高估，而兩翼處的卻被低估。當濃度檢測器在MALS檢測器上游時，情況就反過來。假如沒有頻帶增寬，數據將由一系列平臺組成，對于單體來說是1，對于二聚體來說是2，等等。當被分級的樣品變成更加多分散性時，頻帶增寬效應變得不那么明顯(但是仍然存在)。對于被恰當地分級的具有離散的聚集狀態的樣品，該問題是明顯的。在圖1中，單體的波峰被很好地分辨出來，所以增寬問題是最清楚的。聚集體逐漸變得不能很好地分辨出來，所以它們顯現出該問題的程度就輕些。

人們采用了各種方法來補償這些變形。大多數方法都是基于L.H.Tung在其1969年的論文中介紹的成果，該論文發表在《the?Journal?of?Applied?Polymer?Science》，第13卷，第775等頁。在前面提到的Yau等人的著作討論了一些校正頻帶增寬的方法。在整個色譜技術文獻中，許多論文都提出了實施這些校正的方法，即，將變寬的頻帶恢復到假如沒有增寬因素時它所具有的形狀。這些技術中的大多數在數值上是不穩定的，可能導致實質上不合理的結果，例如負的濃度，或者負的散射強度，因此很少被使用。通過MALS測量得到的蛋白質特征表現為一個相當重要的面積，然而即便在這里，由于存在與實施相關的困難，因此很少見到對頻帶增寬進行校正。

頻帶增寬效應出現在液相色譜的各種多檢測器操作中。例如，如果要使用在線粘度計測量樣品以獲得它的特性粘度，那么也需要使用dRI。當樣品從dRI移動到粘度計時，便會出現頻帶增寬，這導致比粘度曲線相對于由dRI測量獲得的濃度曲線出現擴展。另外，在將變寬的信號恢復為符合在沒有增寬的情況下它所具有的信號時，所存在的計算上的困難常常導致有問題的結果，特別是當樣品確實是單分散性的，例如非聚集的蛋白質時。

發明內容