[發明專利]蘋果屬植物生長素免疫組織定位的方法及其應用

有效

• 申請號: 201110007883.5
• 申請日: 2011-01-14
• 公開（公告）號: CN102147417A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 韓振海;吳婷;王憶;賈文鎖;張新忠
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/577;G01N33/531;G01N1/30
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及蘋果屬植物生長素免疫組織定位的方法及其應用。

背景技術

植物激素是一些在植物體內合成的能從產生部位運送到作用部位，并在低濃度時對生長發育具有顯著生理作用的微量有機物，其可以調控植物生命活動的整個進程。因此對植物激素的研究不僅是了解植物生長發育基本規律的途徑，而且是對植物遺傳、化學和環境調控的有效手段，所以植物激素的研究與應用具有十分重要的理論意義和廣闊的應用前景。近一個世紀的研究已經比較詳細地描述了它們不同的生物學效應，大量的分析化學結果也闡明了這些生物活性分子的化學本質，但是我們仍不清楚它們的作用機理。植物體的形成以及生命活動的循環都需要細胞分裂、伸長和分化的嚴格控制。啟動任何一個信號轉導過程的首要前提就是信號的真實存在，一個被廣泛接受的主要機制就是控制這些過程的激素分布(Iten.M，1999)。對激素的定量分析已經揭示了植物的生長發育和生理過程與激素水平的變化存在相關性，但對于它們在植物器官和組織中的分布情況的了解卻仍然很少。研究激素在特定的細胞和組織內的作用需要能精確描述其分布的技術。植物激素是一些小分子化合物，缺乏免疫原性，被稱為半抗原，需要與載體蛋白偶聯后才能誘導宿主動物對它們產生良好的免疫響應。

對于植物激素這類小分子的免疫定位除了在制片過程中力求保持植物結構的原狀外，還應使待檢測的小分子保持免疫原性，不發生流失或漂移，力求“原位原量固定”。它們在植物細胞基質中的固定可以通過適當的化學或物理方法獲得。利用化學方法把植物激素固定到內部蛋白的過程如EDC反應后，ABA和IAA等可以通過偶聯劑將它們固定結合在周圍的蛋白質上。經過戊二醛反應后，同樣也能通過吲哚環上的氨基部分與蛋白相連。然而，植物中還沒見到有關和通過苯環被固定的報道。

植物激素的免疫定位中一抗的結合位點可以通過偶聯了熒光物質、電子或光不透明標記物或酶的二抗來顯示。但熒光標記的二抗僅適合于在光鏡水平下觀察抗原在組織中的分布，不僅容易受到切片中一些自發熒光的影響，而且切片也不能長期保存，使它的應用受到一定的限制。

植物細胞內存在復雜的信號轉導網絡體系(networks)。了解不同信號之間的相互作用對于我們理解這一復雜的信號轉導網絡體系越來越重要。這一類研究已成為信號轉導領域的研究熱點(Chary?J，2001)。生長素是最早發現的一類植物激素，在植物細胞的信號轉導網絡體系中起主導作用，與其他信號協同作用調節植物細胞的分裂、伸長和分化等發育過程。而對植物特別是木本植物的復雜的應答反應通路中生長素的細胞定位變化研究，對生長素調節植物信號轉導是十分必要的。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種定位檢測植物中激素的方法。

本發明所提供的定位檢測植物中激素的方法，包括以下步驟：

(1)對植物組織進行固定，得到固定后的植物組織；

(2)在步驟(1)基礎上將固定后的植物組織制成石蠟切片，得到植物組織切片；

(3)在步驟(2)基礎上對得到植物組織切片進行免疫染色，并通過觀察陽性信號的位置確定所述激素在植物組織中的分布。

所述步驟(1)中所述對植物組織進行固定的方法包括如下步驟：先將植物組織浸入到1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽水溶液中抽真空，然后將植物組織在FAA固定液中浸泡；

每100mL所述FAA固定液由90mL體積百分比濃度為50％的乙醇水溶液、5mL乙酸和5mL甲醛組成；

所述步驟(2)中所述對固定后的植物組織進行制片的方法包括如下步驟：對所述固定后的植物組織依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片和烘片的處理，得到植物組織切片；

所述步驟(3)中所述對得到植物組織切片進行免疫染色的方法包括如下步驟：對得到植物組織切片依次進行脫蠟、復水、過氧化氫孵育、修復、一抗孵育、二抗孵育和染色。

所述步驟(3)中，所述一抗孵育的方法包括如下步驟：將所述修復后的植物組織切片加入激素單克隆抗體溶液中，4℃放置10h，得到一抗孵育后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述二抗孵育的方法包括如下步驟：將一抗孵育后的植物組織切片加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體溶液，25℃放置30min，得到二抗孵育后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述染色的方法包括如下步驟：將二抗孵育后的植物組織切片加入AEC染色劑，放置10min，或加入DAB染色劑，放置2min，即得到染色后的植物組織切片；

所述步驟(1)中，所述抽真空的溫度為4℃、時間為1小時；所述在FAA固定液中浸泡溫度為4℃、時間為10小時；