[發(fā)明專利]蘋果屬植物生長素免疫組織定位的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110007883.5
• 申請(qǐng)日: 2011-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN102147417A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓振海;吳婷;王憶;賈文鎖;張新忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/74
• 分類號(hào): G01N33/74;G01N33/577;G01N33/531;G01N1/30
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

1.一種定位檢測(cè)植物中激素的方法，包括以下步驟：

(1)對(duì)植物組織進(jìn)行固定，得到固定后的植物組織；

(2)在步驟(1)基礎(chǔ)上將固定后的植物組織制成石蠟切片，得到植物組織切片；

(3)在步驟(2)基礎(chǔ)上對(duì)得到植物組織切片進(jìn)行免疫染色，并通過觀察陽性信號(hào)的位置確定所述激素在植物組織中的分布。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步驟(1)中所述對(duì)植物組織進(jìn)行固定的方法包括如下步驟：先將植物組織浸入到1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽水溶液中抽真空，然后將植物組織在FAA固定液中浸泡；

每100mL所述FAA固定液由90mL體積百分比濃度為50％的乙醇水溶液、5mL乙酸和5mL甲醛組成；

所述步驟(2)中所述對(duì)固定后的植物組織進(jìn)行制片的方法包括如下步驟：對(duì)所述固定后的植物組織依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片和烘片的處理，得到植物組織切片；

所述步驟(3)中所述對(duì)得到植物組織切片進(jìn)行免疫染色的方法包括如下步驟：對(duì)得到植物組織切片依次進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、過氧化氫孵育、修復(fù)、一抗孵育、二抗孵育和染色。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述步驟(3)中，所述一抗孵育的方法包括如下步驟：將所述修復(fù)后的植物組織切片加入激素單克隆抗體溶液中，4℃放置10h，得到一抗孵育后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述二抗孵育的方法包括如下步驟：將一抗孵育后的植物組織切片加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體溶液，25℃放置30min，得到二抗孵育后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述染色的方法包括如下步驟：將二抗孵育后的植物組織切片加入AEC染色劑，放置10min，或加入DAB染色劑，放置2min，即得到染色后的植物組織切片；

所述步驟(1)中，所述抽真空的溫度為4℃、時(shí)間為1小時(shí)；所述在FAA固定液中浸泡溫度為4℃、時(shí)間為10小時(shí)；

所述步驟(2)中，所述脫水的方法包括如下步驟：將固定后的植物組織依次用不同濃度的乙醇水溶液和乙醇進(jìn)行浸泡，得到脫水后的植物組織；

所述步驟(2)中，所述透明的方法包括如下步驟：將所述脫水后的植物組織依次用不同濃度的二甲苯和乙醇的混合溶液和二甲苯進(jìn)行浸泡，得到透明處理后的植物組織；

所述步驟(2)中，所述浸蠟的方法包括如下步驟：將所述透明處理后植物組織先在45℃的熔化石蠟中浸漬3天，然后在60℃的熔化純蠟中浸漬3天，得到浸蠟后的植物組織；

所述步驟(2)中，所述包埋的方法包括如下步驟：向盒中倒入60℃的熔化純蠟，再將所述浸蠟后的植物組織和純蠟一起倒入盒中，待純蠟?zāi)毯蠹吹玫桨窈玫闹参锝M織；

所述步驟(2)中，所述切片的方法包括如下步驟：將所述包埋好的植物組織切成厚度為10μm的薄片；

所述步驟(2)中，所述粘片的方法包括如下步驟：將所述薄片先在溫度為37℃的水中展片，再用防脫載玻片撈片，即得到粘片后的植物組織切片；

所述步驟(2)中，所述烘片的方法包括如下步驟：將所述粘片后的植物組織切片在40℃-70℃放置1小時(shí)-24小時(shí)，具體為在70℃放置1小時(shí)或在55℃放置6小時(shí)或在65℃放置8小時(shí)或在40℃放置24小時(shí)，得到烘片后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述脫蠟的的方法包括如下步驟：將所述烘片后的植物組織切片用二甲苯進(jìn)行浸泡，得到脫蠟后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述復(fù)水的方法包括如下步驟：將所述脫蠟后的植物組織切片依次用不同濃度的乙醇水溶液和乙醇進(jìn)行浸泡，得到復(fù)水后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述過氧化氫孵育的方法包括如下步驟：將復(fù)水后的植物組織切片放入過氧化氫溶液中放置20min，得到過氧化氫孵育后的植物組織切片；

所述步驟(3)中，所述修復(fù)的方法包括如下步驟：將所述過氧化氫孵育后的植物組織切片浸入到枸櫞酸緩沖液中放置10min，得到修復(fù)后的植物組織切片；每500mL所述枸櫞酸緩沖液由9mL?0.1mol/L枸櫞酸、41mL?0.1mol/L枸櫞酸鈉和水組成，用水補(bǔ)足體積，pH值為6.0。