[發明專利]一種透明質酸的制備方法

有效

• 申請號: 201110006226.9
• 申請日: 2011-01-13
• 公開（公告）號: CN102154405A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 毛自朝;楊發祥;尚海麗;程倩
• 申請（專利權）人: 云南省微生物發酵工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司 53100
• 代理人: 金耀生

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技術領域

本發明涉及微生物的基因工程技術領域，具體是以質粒形式或以基因組整合方式構建的工程大腸桿菌生產透明質酸的制備方法。

背景技術

大腸桿菌K12株系因清晰的遺傳背景、擁有眾多高效的遺傳轉化系統和基因組的易操作性而被廣泛應用在代謝工程領域，以生產各式各樣的高附加值產品。目前尚未發現天然的大腸桿菌菌株有生產透明質酸的能力。

透明質酸(Hyaluronic?acid，HA)最早從牛眼中分離得到的一種具有高黏度氨基多糖。透明質酸廣泛存在人和動物組織內，其分子量在5×10⁴到8×10⁶道爾頓之間，是由β-1,4-糖苷鍵連接的葡萄糖醛酸及β-1,3-糖苷鍵連接的氮乙酰基葡萄糖胺（β1-4?D-Glucuronic?acid,?GlcA?，β1-3?D-N-acetylglucosamine?,?GlcNAc）交替連接而成的直鏈聚合物。研究證實，該多糖作為結構與信號分子參與了哺乳動物的受精、胚胎發育、血管再生和關節潤滑等眾多生理活動；同時在炎癥與損傷修復、維持皮膚的水分與彈性方面也有重要作用。

研究發現，特定長度的HA寡糖鏈在抗腫瘤免疫異常修復等方面發揮著重要功能。由于透明質酸獨特的化學特性與生理功能，?HA及源于HA的寡糖鏈被廣泛應用于眼科手術、關節炎治療、抗腫瘤、給藥方式、化妝品工業等諸多方面，僅2008年HA做為原料，在全球市場的交易金額約為10億美元并有逐年增加的趨勢。

自然界中HA廣泛存在，如動物組織哺乳動物病原菌的細胞被膜及病毒PBCV-1浸染的小球藻等。目前商用HA主要從動物組織(如雞冠，臍帶、牛眼、關節滑液)，和培養人與高等哺乳動物的病原菌（如鏈鎖狀球菌,?Streptococci?）中提取。出于資源限制、成本問題及藥物安全等諸方面的考慮，上述生產絕非理想方式，國際社會極力探索更為經濟、安全和持續的生產HA的方法。

分子生物學及生物技術的發展，為上述問題的解決提供了重要的手段。對HA在動物與微生物中合成機理，諸多HA的合成過程必需基因的克隆等研究，都為通過代謝工程的手段，在安全的宿主生物中重建或改造合成途徑來生產HA奠定了堅實的基礎。

2004年?日本學者祡谷滋郎等(中國專利申請號為200480022328.8)通過在轉基因植物中表達從人類和草履蟲病毒（PBCV-1）中得到的HA合成基因（Has）來嘗試HA在植物組織中的合成。Widner?B?等?(Bill?Widner?et?al?.,Hyaluronic?Acid?Production?in?Bacillus?subtilis?Appl.?Environ.?Microbiol.?2005,?71(7):??3747–3752)?在枯草芽孢桿菌中成功表達從革蘭氏陽性的鏈鎖狀球菌中得到的HA合成基因，工程芽孢桿菌在普通的三角瓶中發酵獲0.5-0.6g／L?HA?含量。

然而在植物中生產透明質酸，因植物的轉化難，生長周期受季節限制，許多保守環保人士反對轉基因植物，及轉基因植物本身存在對環境安全的潛在危害等而受到應用限制。對于枯草芽孢桿菌，因該菌有產生內毒素，各種大環脂類和脂肽類抗生素的報道，而會導致經發酵、用于醫藥領域HA的分離純化成本增高，產率降低等系列問題。

許多來源于人體腸道的大腸桿菌是維護腸道微生物平衡及人體健康的有益細菌。加之大腸桿菌K12株系具清晰的遺傳背景、擁有眾多高效的遺傳轉化系統和基因組可操作性，而被廣泛應用在代謝工程領域以生產高附加值的生物產品。對于用大腸桿菌為宿主進行工程改造生產透明質酸的首次報道是美國麻省理工學院的Stephanopoulos?G研究組。2008該研究組通過在大腸桿菌中表達革蘭氏陽性鏈鎖狀球菌HA合成基因spHas?和全新合成，優化過密碼子并用于大腸桿菌表達的seHas基因，該研究獲得最高約?0.2g/L的HA產量。該工程大腸桿菌因HA合成產率低而難以獲得產業化運用。

發明內容

本發明的目的是提供一種以高效產透明質酸工程大腸桿菌生產的透明質酸的制備方法。克服現有技術中生產透明質酸的資源短缺、安全性問題以及在工程大腸桿菌中較低透明質酸合成的問題。

本發明用一種表達透明質酸合成酶基因（hyaluronic?acid?synthase?Has）和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因（UDP-glucose?Dehydrogenase）的高效產透明質酸工程大腸桿菌來生產透明質酸。