[發明專利]一種透明質酸的制備方法

有效

• 申請號: 201110006226.9
• 申請日: 2011-01-13
• 公開（公告）號: CN102154405A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 毛自朝;楊發祥;尚海麗;程倩
• 申請（專利權）人: 云南省微生物發酵工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司 53100
• 代理人: 金耀生

1.一種透明質酸的制備方法，其特征在于用工程大腸桿菌pHK/JM109生產透明質酸的搖瓶培養合成按以下進行：?在500ml-2500ml?三角瓶中，以總體積100ml-500ml?含25-50?mM?K₂HPO₄·3H₂O,?pH6.5-7.2，2-4mM?g/L?MgSO4·7H2O,?20-40?mM/L?檸檬酸,?1-2?mM?MnCl₂,?300-400?mM?葡萄糖50-75?mM?氮乙酰葡萄糖胺,5-10?mM?乳糖、10-30?g/L?甘油、3-5g/L酪蛋白酸水解物(?Casamino?acid)的體系中加入已表達pmHas和kfiD的pHK/JM109，使菌體細胞濃度達4-5%?W/V,?發酵條件為30-33?℃，250?rpm，并用28%?V/V的氨水調節pH至中性，發酵反應時間為30-36小時。

2.一種透明質酸的制備方法，其特征在于用工程大腸桿菌pHK/JM109生產透明質酸的發酵罐培養合成按以下進行：從Amp50-100ug/ml+Km25-100ug/ml的LB平板上挑起3-5經劃線并過夜培養的pHK/JM109單菌落，置于100ml?TB培養基(Terrific?Broth)，過夜培養；該培養物經離心收集菌體，菌體用20-50ml?TB懸浮，全部轉入1-5L的發酵罐，發酵罐培養基為TB培養基并含Amp50-?100?ug/ml+Kmn25-100?ug/ml，總體積為600-3000?ml，控制溫度37℃，轉速1200?rpm,?通入流量為60?ml/min?的混合氣體，即氧氣：空氣1：10?v/v，并用28%?V/V氨水及4?mol/L?HCl?調節pH至6.8-7.2?，培養4?小時，當培養物OD₆₀₀達到5時，加入IPTG使其終濃度達0.5-1?mM，同時將反應溫度調節至30-33?℃培養2?小時，此時加入50%?W/V葡萄糖和10%?W/V磷酸銨?pH6.8?，使發酵液中葡萄糖和磷酸銨含量分別為50?g/L和1?g/L,?30?℃培養10?小時后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸銨使其濃度分別為0.5?mM、50?g/L和1?g/L，混合液30?℃培養14－30小時后完成發酵，得到2-3?g/L濃度的透明質酸。