[發明專利]具高腸毒殺蟲活性的轉基因生防真菌及其構建法和用途

有效

• 申請號: 201110005779.2
• 申請日: 2011-01-12
• 公開（公告）號: CN102154127A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 馮明光;王正亮;應盛華
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/31;C12N15/113;C12N15/63;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及生物工程技術領域的DNA重組技術和應用，具體涉及一種利用轉基因工程技術大幅增強生防真菌腸毒殺蟲活性的方法。

背景技術

絲孢類昆蟲病原真菌是重要的害蟲生防真菌，一般通過體壁接觸感染致死各類害蟲，但通常不具有經口器攝入侵染的腸毒殺蟲活性。真菌侵染過程包括分生孢子在昆蟲體壁上的附著、萌發及體壁穿透，然后進入寄主血腔并在其中快速繁殖，終因耗盡寄主營養而導致寄主死亡。獨特的侵染方式使絲孢類生防真菌成為防治刺吸式口器害蟲的首選生防因子。絲孢類生防真菌的成員很多，如白僵菌Beauveria、綠僵菌Metarhizium、棒束孢屬Isaria?（=擬青霉Paecilomyces）和蠟蚧菌屬Lecanicillium（=輪枝菌屬Verticillium）等昆蟲病原真菌的菌種菌株，是支撐無公害農業的害蟲防治新技術及產品來源。目前全世界注冊登記的絲孢類真菌殺蟲劑近200種，其主要活性成份大都是極易低成本生產的分生孢子，用于多種農林害蟲的防治。

絲孢類生防真菌防治害蟲的持效性較好，但殺蟲速度較為緩慢，成為影響真菌殺蟲劑應用推廣的限制因素，也是國際上的重大技術難題之一。作為絲孢類生防真菌的典型代表，球包白僵菌穿透害蟲體壁通常發生在接種后的48小時左右，再經血腔內的繁殖，一般經歷因蟲體大小而異的數天潛伏期才能殺死害蟲。由于生防真菌沒有特異的腸道毒力因子，只能依賴分生孢子萌發后穿透體壁的方式感染寄主，被咀嚼式口器害蟲攝入的大量孢子一般不能在腸道導致實質性的感染。真菌殺蟲的時滯效應使其很難用于防治暴食性葉面害蟲，限制著菌劑的應用范圍。因此，有效提高球孢白僵菌對暴食性葉面害蟲的快速毒殺能力是一重大技術挑戰。Vip3A是一類由蘇云金芽孢桿菌在營養生長期分泌的、具有信號肽的殺蟲蛋白，直接作用于昆蟲中腸上皮細胞(主要是柱狀細胞)，誘發昆蟲細胞凋亡和核溶解，導致昆蟲死亡，對鱗翅目害蟲具有較廣譜的殺蟲活性。然而，Vip3A殺蟲蛋白在細胞培養物中的分泌量很低，加之非晶體結構的不穩定性，不能像蘇云金芽孢桿菌的晶體內毒素那樣開發成可直接用于田間的殺蟲劑產品。迄今，全球Vip3A蛋白的應用僅限于轉基因抗蟲植物。新近的研究表明，利用害蟲Vip3A腸毒蛋白改造殺蟲真菌，使其不僅能夠經昆蟲體壁侵染，而且攝入腸道的真菌孢子可釋放腸毒蛋白，從而加快低齡斜紋夜蛾幼蟲的死亡（Qin?et?al.,?2010）。雖然將Vip3Aa1蛋白基因置于構巢曲霉的通用組成型啟動子PgpdA下導入球孢白僵菌能提高其對斜紋夜蛾低齡幼蟲的毒殺效果，但重組菌株對三齡以上齡期幼蟲的毒殺效果不佳（Qin?et?al.,?2010），說明PgpdA不足以啟動外源基因在生防真菌分生孢子中的高表達。因此，有必要尋找一種超強啟動子來啟動外源殺蟲蛋白基因的高效表達，為提升真菌殺蟲劑的質量和實用性提供新的技術途徑。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種找到一種超強啟動子、能建立生防真菌通常不具有的獨特殺蟲機制和殺蟲活性顯著增強的Vip3A殺蟲蛋白超高表達的工程菌株構建方法，并獲得相應的工程菌株。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種具高腸毒殺蟲活性的轉基因生防真菌，該菌株BbHV8的保藏名稱為：球孢白僵菌Beauveria?bassiana；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期：2010年12月8日，保藏編號：CGMCC?No.?4438。

本發明還同時提供了一種具高腸毒殺蟲活性的轉基因生防真菌的構建方法，包括以下步驟：

（1）獲得內源強啟動子：

利用球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列設計引物，克隆其N端啟動子全長序列Phyd1（1798?bp）；不同長度或實施轉錄因子定點突變的啟動子片段通過其啟動外源報告基因（綠色熒光蛋白基因eGFP）的表達進行定量比較，找到啟動綠色熒光蛋白表達量最大的啟動子片段為球孢白僵菌疏水蛋白啟動子Phyd1的優化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白啟動子Phyd1的優化片段作為Phyd1優化后的強啟動子核心序列，該片段攜帶3個缺一不可的轉錄因子；

（2）獲得異源殺蟲蛋白基因：