[發(fā)明專利]具高腸毒殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌及其構(gòu)建法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110005779.2
• 申請日: 2011-01-12
• 公開（公告）號: CN102154127A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮明光;王正亮;應(yīng)盛華
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/31;C12N15/113;C12N15/63;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.具高腸毒殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌，其特征是：菌株BbHV8的保藏名稱為：球孢白僵菌Beauveria?bassiana；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2010年12月8日，保藏編號：CGMCC?No.?4438。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具高腸毒殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟：?

（1）獲得內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子：

利用球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列設(shè)計(jì)引物，克隆其N端啟動(dòng)子全長序列Phyd1；不同長度或?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄因子定點(diǎn)突變的啟動(dòng)子片段通過其啟動(dòng)外源報(bào)告基因的表達(dá)進(jìn)行定量比較，找到啟動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá)量最大的啟動(dòng)子片段為球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子Phyd1的優(yōu)化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子Phyd1的優(yōu)化片段作為Phyd1優(yōu)化后的強(qiáng)啟動(dòng)子核心序列，該片段攜帶3個(gè)缺一不可的轉(zhuǎn)錄因子；

（2）獲得異源殺蟲蛋白基因：

針對目標(biāo)害蟲選擇適當(dāng)?shù)腣ip3A殺蟲蛋白基因，構(gòu)建合適的酶切位點(diǎn)，用合成的方法獲得目標(biāo)蛋白基因Vip3Aa1，所述Vip3A為殺蟲蛋白家族成員之一；

（3）構(gòu)建攜帶Vip3A蛋白基因和選擇標(biāo)記基因的二元表達(dá)載體：

將步驟（2）所得的目標(biāo)蛋白基因Vip3A置于步驟（1）所得的球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子Phyd1的優(yōu)化片段以及構(gòu)巢曲霉（Aspergillius?nidulans）色氨酸基因的終止子TtrpC之間；然后與生防真菌篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因bar表達(dá)元件串聯(lián)成二元表達(dá)載體；

（4）獲得生防真菌的重組工程菌株：

將步驟（3）構(gòu)建所得的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌，篩選后獲得組成型超高表達(dá)Vip3A蛋白基因的重組工程菌株——保藏名稱為：球孢白僵菌Beauveria?bassiana的菌株BbHV8。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具高腸毒殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法，其特征是：所述步驟（4）中的生防真菌為昆蟲病原真菌的菌種菌株，所述昆蟲病原真菌為白僵菌屬Beauveria、綠僵菌屬Metarhizium、棒束孢屬Isaria或蠟蚧菌屬Lecanicillium。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具高腸毒殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法，其特征是：將步驟（3）構(gòu)建所得的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌的方法為：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、芽生孢子轉(zhuǎn)化或電擊轉(zhuǎn)化。

5.如權(quán)利要求1所述的具高腸毒殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的用途，其特征是：用于腸毒殺蟲。