[發(fā)明專利]聚酰胺胺、其部分降解產(chǎn)物或其復(fù)合物-Math1基因納米微粒以及在治療耳聾的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110005066.6
• 申請日: 2011-01-04
• 公開（公告）號: CN102586300A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊仕明;吳南;吳雁;韓東;郭維維;趙立東;翟所強(qiáng);高維強(qiáng);楊偉炎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍總醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;A61K48/00;A61P27/16
• 代理公司: 北京律誠同業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11006
• 代理人: 祁建國;梁揮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及聚酰胺胺(PAMAM)、其部分降解產(chǎn)物或其復(fù)合物-Math1基因納米微粒、其制備方法及其在治療耳聾上的應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，以非病毒材料為基因載體的基因治療研究引起了廣泛的重視，其中用陽離子聚合物和基因復(fù)合形成納米微粒來模擬類似病毒的結(jié)構(gòu)作為基因載體就是一個(gè)重要方面。納米微粒(nanoparticle，NP)基因載體是由高分子材料合成的一種固態(tài)膠體納米級微粒載體，其能將DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(雙鏈RNA)等基因治療分子包裹在納米微粒之中或吸附在納米微粒表面，通過細(xì)胞胞吞使納米微粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)高分子材料的降解逐漸釋放出基因治療分子，從而發(fā)揮其基因治療的效能。

大量研究表明，在一定條件下，聚陽離子可與基因在水溶液中復(fù)合形成納米微粒。同時(shí)，可以在聚陽離子鏈上引入具有特殊功能的基團(tuán)(如半乳糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白)，從而使聚陽離子/基因納米微粒具有類似病毒的功能，如受體調(diào)節(jié)內(nèi)化、進(jìn)入細(xì)胞核等。聚陽離子作為基因載體在血漿的電解質(zhì)環(huán)境中仍是穩(wěn)定的納米微粒，且在冷凍干燥儲(chǔ)存過程中并不失活。

聚酰胺胺(PAMAM)是一種代表性的人工合成樹枝狀聚合物，在生理pH值范圍內(nèi)，其表面氨基基團(tuán)會(huì)攜帶正電荷，是常見的陽離子高分子聚合物。它具有獨(dú)特的球形外形，以及高度分支的納米級樹枝狀結(jié)構(gòu)。該分子由三部分組成：中心核、內(nèi)層重復(fù)的亞單元和外層的氨基端，它具有良好的流體力學(xué)性能，易于加工成型；同時(shí)它還具有低粘度、高水溶性、可混合性、高反應(yīng)性等特點(diǎn)，相比之下，其它陽離子聚合物如殼聚糖等，其質(zhì)子化需要較低的pH值，而且粘度較大，水溶性欠佳。在生物性能方面，聚酰胺胺具有無免疫性、毒性較低、可通過尿和糞便排出體外的優(yōu)異性能。

隨著代數(shù)的增加，PAMAM樹枝狀聚合物末端的氨基基團(tuán)增加。氨基基團(tuán)在生理PH下，發(fā)生質(zhì)子化，使PAMAM具有聚陽離子特征。帶電荷易于與抗體、核酸和熒光基團(tuán)通過靜電作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物(Haensler?and?Szoka，1993；Bielinska?et?al.，1996；Wang?et?al.，2000)。研究表明，PAMAM可以介導(dǎo)核酸、質(zhì)粒等進(jìn)入細(xì)胞中，并獲得目的基因表達(dá)。其機(jī)理是帶正電荷的PAMAM/DNA復(fù)合物易于粘附于負(fù)電荷的細(xì)胞表面，利于其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并表達(dá).(Dennig?J?and?Duncan?E，2002)。PAMAM對于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性會(huì)隨代數(shù)的增加而同時(shí)增加，該特性與被轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞有關(guān)。

耳蝸是人類感受外界聲音刺激的唯一器官，同時(shí)也是一種高度分化的功能特化器官，其內(nèi)部的毛細(xì)胞是感受聲音振動(dòng)的機(jī)械-電感受器，對維持聽覺及平衡覺有重要作用。任何原因?qū)е碌膬?nèi)耳毛細(xì)胞的變性、壞死均可引起聽覺和平衡功能障礙。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為鳥類及哺乳類動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞在胚胎期完成分化，且不能自發(fā)再生，一旦發(fā)生由于耳蝸毛細(xì)胞損失而導(dǎo)致的耳聾就很難自然恢復(fù)聽力，必須通過人為的治療才有可能恢復(fù)，而這一直是個(gè)世界性的難題。近年來有研究表明，耳毒性藥物和噪聲損傷哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞后，毛細(xì)胞可以經(jīng)誘導(dǎo)再生。許多生長因子在毛細(xì)胞再生中起重要作用，如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等等。

Math1(Mammalian?atonal?homolog?1)是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)基因，其是果蠅Atoh1基因的小鼠同源基因。Math1基因全長1.18kb，含一個(gè)外顯子，mRNA長1065bp，編碼由354個(gè)氨基酸組成的蛋白，即轉(zhuǎn)錄因子Math1，分子量為38.2kDa。Math1基因是毛細(xì)胞分化成熟的必需基因，在毛細(xì)胞再生過程中有重要作用(Bermingham?NA，Hassan?BA，Price?SD?et?al.，Math1：anessential?gene?for?the?generation?of?inner?ear?hair?cells.Science，1999，284：1837-1841)。

由于病毒載體的局限性，利用病毒載體在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的研究無法應(yīng)用于臨床。納米微粒作為一種新型基因載體，以其無免疫原性，低毒、裝載容量大、制備容易且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、利于改造和修飾等優(yōu)勢，更有利于毛細(xì)胞再生的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用。