[發明專利]巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒

有效

• 申請號: 201110004921.1
• 申請日: 2011-01-12
• 公開（公告）號: CN102146447A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 夏慶杰;劉欽松
• 申請（專利權）人: 山東博奧克生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種聚合酶鏈式反應試劑盒，具體是涉及一種，比常規聚合酶鏈式反應試劑盒技術更高特異性、更高擴增效率的巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，屬于分子生物學檢測技術中的DNA體外擴增技術領域。

背景技術

在現有的DNA體外擴增技術中，聚合酶鏈式反應是最主要的也是很有效的常用技術，在常規聚合酶鏈式反應試劑盒中，由于經常遇到引物二聚體和其它非特異性擴增的產生，而一旦產生非特異性模板，由于其與特異性擴增的效率相當，并竟爭底物與酶，往往與特異性擴增差不多同時進入擴增的平臺期，這不僅使擴增結果難以判斷，而且使特異性擴增效率降低，尤其在擴增粗提的臨床標本時，常導致臨床基因診斷的假陽性和假陰性結果的產生。

用于提高聚合酶鏈式反應試劑盒擴增特異性的方法，已有熱啟動法、固體石蠟膜法、抗體-酶法、雙鏈引物法，這些方法雖然都能在一定程度上提高聚合酶鏈式反應試劑盒擴增的特異性與其擴增效率，但與常規聚合酶鏈式反應試劑盒相比都只是略有改進，而沒有本質的變化，特異性擴增效率都不會超過2ⁿ倍。

巢式聚合酶鏈式反應試劑盒是一種特異性很高的聚合酶鏈式反應試劑盒，其本質是在一段待擴增的靶序列中設計外側、內側兩對引物，先用外側引物進行擴增，完成后再取擴增產物作模板用內側引物擴增，即要進行兩次連續的聚合酶鏈式反應，這種方法操作較復雜，費時較長，而其每一次的聚合酶鏈式反應試劑盒中，擴增的效率也不會超過2ⁿ倍，同時由于第二次擴增要用外側引物擴增的聚合酶鏈式反應試劑盒產物做模板，很容易造成聚合酶鏈式反應試劑盒產物污染，導致擴增的假陽性。

發明內容

本發明的目的在于建立一種操作簡單，特異性擴增效率超過2ⁿ倍的、高特異性的DNA體外擴增技術，即巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，其英文名稱是nest?coamplific?ationpolymerase?chain?reaction，英文縮寫是NCA-PCR。

本發明的技術方案是：

首先根據待擴增靶DNA序列合成一對特異的外側引物和一對特殊的巢式引物，然后將內側與外側引物放入同一個含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、聚合酶鏈式反應緩沖液、超純水等組成的聚合酶鏈式反應擴增緩沖反應體系中，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反復熱循環，使內外側引物同時引導新鏈合成，獲得分別由內內、外外、內外側引物界定的聚合酶鏈式反應產物；由于每一循環中合成的由外外、內外側引物界定的聚合酶鏈式反應產物都可以作為內內引物附加的模板，使內內引物引導的聚合酶鏈式反應產物以超過2倍的速度增加，經過n個循環，其理論值為初始模板量的1/4(n²+3n)2ⁿ倍，大大提高了特異性擴增的效率。

所用擴增緩沖反應體系是由引物、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、聚合酶鏈式反應緩沖液、超純水等組成的，各個成分的終濃度分別如下：特異的引物每條0.2-0.4umol/L、Taq?DNA聚合酶1-3U/50ul、dNTPs底物0.2-0.5mmol/L、模板DNA若干、Mg++1.5-3.5mmol/L、緩沖液1-1.5XPCR；其中1XPCR緩沖液包括50mmol/L?KCl、10mmol/LTris、HCl?PH8.3、0.01％明膠。

該巢式共擴增聚合酶鏈式反應由于每一循環中合成的由外外、內外側引物界定的聚合酶鏈式反應產物都可以作為內內引物附加的模板，使內內引物引導的聚合酶鏈式反應產物以超過2倍的速度增加，經過n個循環，其理論值為初始模板量的1/4(n²+3n)2ⁿ倍，與常規巢式聚合酶鏈式反應方法相比，具有以下優點：1、操作簡便快速，只做一次聚合酶鏈式反應即可達到巢式擴增的提高特異性的效果；2、擴增前不進行聚合酶鏈式反應產物操作，減少可能出現的聚合酶鏈式反應產物污染；3、自動化程度高，人工成本低，還可以高通量檢測，每次可以檢測90個以上標本；4、需要的檢測樣本材料微量，每個反應最低僅需要待檢靶DNA?10拷貝，便于取材。

根據上述巢式共擴增聚合酶鏈式反應原理，將上述引物和其他聚合酶鏈式反應試劑混合后分裝到聚合酶鏈式反應擴增管中，并配以系列稀釋度的標準DNA模板組裝成巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒。

有鑒于此，我們設計了一種操作簡單、特異性高、特異性擴增效率超過2n倍的DNA體外擴增技術即巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒。

附圖說明

附圖是本發明的原理示意圖

具體實施方式