[發明專利]一種對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸及其應用

有效

• 申請號: 201110004826.1
• 申請日: 2011-01-11
• 公開（公告）號: CN102154466A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 王磊;曹勃陽;孫亞民;何欣;王敏
• 申請（專利權）人: 天津生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/36
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明涉及一種對腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria?meningitidis)中16S?rRNA-23S?rRNA基因間區(Internal?transcribed?spacer，以下簡稱ITS)特異的寡核苷酸及其應用。

背景技術

人類是腦膜炎奈瑟氏菌的唯一宿主。腦膜炎奈瑟氏菌作為條件致病菌，常存在于患者或帶菌者的鼻咽腔黏膜中，約有5～10％的健康人鼻咽部帶有本菌，流行期高達20～70％，其排菌時間可達數周至2年。病原菌借飛沫直接由空氣傳播，大部分感染者臨床癥狀不明顯，因此很多感染者成為無癥狀的攜帶者。在非流行期，發病率在1/10～3/10萬左右，而在流行期，發病可高達500/10萬，對6個月到2歲的嬰幼兒及青少年危害極大，即使在及時和適當的照顧下，該病的致死率也有10％到20％甚至超過50％。大約20％的人群在任何給定時間都有腦膜炎奈瑟氏菌寄生，無論是在發展中國家或是發達國家均可以引起較高的流腦發病率和死亡率。

流行性腦脊髓膜炎是由腦膜炎奈瑟氏菌引起的急性化膿性腦膜炎，為急性呼吸道傳染病。我國流腦發病率有明顯上升的趨勢，暴發流行時有發生，對我國人民的生命健康構成極大威脅。主要臨床表現為發熱、頭痛、嘔吐、皮膚粘膜瘀點、瘀斑及腦膜刺激征，重者可有敗血癥性休克和腦膜腦炎，腦脊液可呈化膿性改變。流行性腦膜炎常見的并發癥為關節炎、硬腦膜下積液或積膿。暴發性敗血癥的致死率高于流行性腦脊髓膜炎。每年大約有一百萬人感染細菌性腦膜炎，并有20萬人因此死亡。54％的幸存者會留下殘疾，包括失聰，智力遲鈍、失明、肢體癱瘓、智能及精神改變和腦積水。

目前，對腦膜炎奈瑟氏菌傳統的診斷主要依靠對腦脊液的涂片鏡檢、病原體培養、免疫學檢查抗原抗體以及從腦脊液、血液中分離培養出腦膜炎奈瑟氏菌。該法確診腦膜炎奈瑟氏菌感染至少需2～3天，其中血清學鑒定因其靈敏度不夠高，影響因素較多，有時難于作出可靠診斷，尤其在大規模流行病學調查時，常因工作量大，檢測者經驗不足、情緒波動等主觀因素而影響結果可信度。傳統方法特異性差、靈敏度低且費時。腦膜炎奈瑟菌對干燥、寒冷、熱、陽光等非常敏感，在室溫中3小時就死亡，同時受抗生素使用及其他非特異性因素的影響，單獨采用細菌培養方法會導致腦膜炎奈瑟菌漏檢。

近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的鑒定、檢測及病害診斷中，包括轉錄間隔區(ITS)序列分析、隨機擴增長度多態性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態性(RFLP)分析等。和傳統檢測技術相比，這些基于多聚酶鏈式反應(PCR)的分子檢測技術，不需要經過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強等優點。

核糖體內轉錄間隔區(ITS)，是介于16S?rRNA和23S?rRNA之間的區域，在幾乎所有細菌的基因組中都以單拷貝或多拷貝的形式存在，相對較短(200bp-1000bp)。該區域進化速率較快，具有超變位點，它的變異速率相當于16S?rRNA或者23S?rRNA的十倍左右，在種內不同菌株間高度保守，而在細菌的種間存在著豐富的變化。因此具有很高的分辨率，更易區分開進化關系很近的菌種，大大增強了檢測的特異性。可以為研究細菌的系統發育、分類鑒定和分子檢測提供豐富的遺傳信息。

熒光定量PCR法的檢出率高于常規PCR法，并且具有靈敏度高、特異性強、重復性好、自動化程度高等特點。它的技術更先進，操作更便捷，避免常規PCR反應后檢測的煩瑣步驟，并能達到實時監測、絕對定量的目的。無論是在陽性符合率和陰性符合率上都要優于分離培養法和直接涂片法，能檢測一些不能被培養或者很微量的樣品，對樣品運輸條件也比較寬松。熒光定量PCR法檢測腦膜炎奈瑟氏菌具有高靈敏性、高特異性和高精確定量等特點，可為流腦檢查提供一種快速、方便的病原學診斷手段，具有實用價值。

該技術相對于傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物及探針介導下的熒光定量PCR過程中擴增目標序列，發出熒光信號，達到檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。熒光定量PCR的擴增過程僅需1個小時。這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

發明內容

本發明的一個目的是提供了一種對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸；

本發明的另一個目的是提供該特異核苷酸的應用，設計引物和探針，通過優化和設計，提供一種用于檢測腦膜炎奈瑟氏菌的熒光定量PCR試劑盒，并利用該熒光定量PCR試劑盒檢測腦膜炎奈瑟氏菌的存在。