[發明專利]一種對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸及其應用

有效

• 申請號: 201110004826.1
• 申請日: 2011-01-11
• 公開（公告）號: CN102154466A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 王磊;曹勃陽;孫亞民;何欣;王敏
• 申請（專利權）人: 天津生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/36
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸，所述核苷酸包含：

a)SEQ?ID?NO：1-3所示的核苷酸序列或者其互補DNA或RNA序列；

b)不同于a)但編碼的氨基酸序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列；

c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。

2.一種權利要求1所述的對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異核苷酸的分離方法包括下述步驟：(1)基因組的提取；(2)通過PCR擴增腦膜炎奈瑟氏菌中的ITS基因簇；(3)構建ITS克隆；(4)對ITS克隆測序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特異引物和探針的篩選。

3.權利要求1所述的對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸作為引物和探針用于熒光定量PCR試劑盒或一般PCR試劑盒或作為探針用于雜交反應與熒光檢測或用于制造基因芯片或微陣列以檢測細菌方面的應用。

4.權利要求3所述的應用，其中的熒光定量PCR試劑盒，包括引物、探針、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶；所述的熒光定量PCR引物和探針包括：

1)SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列；

2)不同于1)但編碼的氨基酸序列與1)所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

3)上述2)或2)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。

5.權利要求3所述的應用，其中的熒光定量PCR檢測試劑盒包括如下試劑：25mM?MgCl₂50μl；10mM?dNTP?10μl；10×酶特異性反應緩沖液50μl；5U/μl耐熱DNA聚合酶5μl；引物和探針各10μl；陽性對照品10μl，陰性對照品10μl；超純水1ml。

6.一種含有對腦膜炎奈瑟氏菌ITS特異的核苷酸的熒光定量PCR試劑盒在檢測腦膜炎奈瑟氏菌中的應用。

7.一種檢測腦膜炎奈瑟氏菌的熒光定量PCR檢測方法包括以下步驟：

(1)提取待測臨床樣品模板；

(2)在8聯PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl₂、10×酶特異性反應緩沖液、rTaq聚合酶、引物、探針、待測樣品模板和超純水，混勻；

(3)將8聯薄壁PCR管中混勻的混合物在熒光定量PCR儀上擴增；

(4)記錄結果，分析并進行結果判斷；

其中上述步驟(1)中的臨床樣品模板為是臨床樣品中的腦脊液、血液或皮膚出血斑內容物或帶菌者的鼻咽拭子標本粗提液或是腦膜炎奈瑟氏菌的純培養物的粗提液或是純DNA，或者是陽性對照品和陰性對照品；

上述步驟(3)中的熒光定量PCR儀上的反應循環參數包括DNA的變性、復性、延伸的溫度和時間、循環次數，具體為：

前期為使變性能夠達到所需溫度而必需的前期處理過程的一個循環為95℃，2分鐘；

變性溫度和時間為95℃，15秒；

復性和延伸溫度和時間為60℃，60秒；

變性、復性、延伸的循環次數為40個循環；

待反應結束后直接觀察反應示意圖即可得到檢測結果。