[發(fā)明專利]一種CAMV35S基因檢測用引物、相應的試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110003792.4
• 申請日: 2011-04-02
• 公開（公告）號: CN102140516A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發(fā)明（設計）人: 曹以誠;杜正平;李志勇;高東微;陳洵;譚慧媚
• 申請（專利權）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術領域

本發(fā)明涉及檢驗檢測領域，具體涉及一種CAMV35S基因檢測用引物、相應的試劑盒及檢測方法。

背景技術

CAMV35S基因為花椰菜花葉病毒的35S啟動子，廣泛應用于轉基因大豆、玉米、油菜、馬鈴薯及番茄等轉基因農作物。

為了加強對轉基因產品的監(jiān)督和管理，目前發(fā)展了多種轉基因成分檢測方法，從基于蛋白質的?ELISA?檢測技術到基于核酸的聚合酶鏈式反應（PCR）技術以及快速發(fā)展的基因芯片技術。其中?PCR?檢測技術以其靈敏性、特異性、高效性而最為通用，這種技術通過檢測轉基因產品中含有的外源核酸片段來鑒定，隨著熒光實時定量聚合酶鏈式反應（real?time?PCR）的出現(xiàn)，不僅能夠進行轉基因產品的定性鑒定，而且可以對轉基因成分進行定量。

以?PCR?技術為代表的轉基因產品檢測技術在實際應用中也存在一些問題，如普通?PCR?技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而?Real?time?PCR?技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。基因芯片技術能夠實現(xiàn)快速和高通量的檢測，然而價格昂貴，檢測成本高。所以及時運用生物技術發(fā)展的最新成果對滿足轉基因產品檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫擴增（Isothermal?Amplification）核酸快速檢測技術是轉基因產品檢測技術上的長足進步，現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated?isothermal?amplication?of?DNA,?簡稱LAMP）具有很多的優(yōu)越性，且目前也未見有用環(huán)介導等溫擴增技術檢測轉基因作物?CAMV35S?基因快速診斷試劑盒。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有診斷CAMV35S?基因中存在的成本高。設備復雜、不利于快速檢測等問題，提供一種快速、簡單、成本低、設備簡單的CAMV35S基因檢測用引物。

本發(fā)明另一目的在于提供包含上述CAMV35S基因檢測用引物的試劑盒。

本發(fā)明還有一個目的在于提供一種快速檢測CAMV35S基因的方法。

本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明的轉基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因檢測用引物組，是基于環(huán)介導等溫擴增技術，根據(jù)已公開的轉基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因序列，選取轉基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因的特異性序列，然后分析設計出的，能專一性鑒別轉基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因的特異性引物組，通過PCR來鑒定轉基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因，該引物組由如下四條引物組成：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1或5所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2或6所示；

內引物FIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3或7所示；

內引物BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4或8所示。

本發(fā)明的轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒，是由兩對引物、Bst?DNA?聚合酶、反應液、穩(wěn)定液、顯色液和陽性對照液組成，上述每1L反應液中含有1.6~2mmol?dNTP、20~25mmol?Tris-HCl、10~12.5mmol氯化鉀、10~12.5mmol硫酸銨、8~10mmol硫酸鎂、1~1.25ml?TritonX-100、0.8~1mol甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6~2μmol和外引物?F3/B3各0.2~0.25μmol；優(yōu)選的比例是每1L反應液中含有2mmol?dNTP、25mmol?Tris-HCl、12.5mmol氯化鉀、12.5mmol硫酸銨、10mmol硫酸鎂、1.25ml?TritonX-100、1mol甜菜堿、內引物FIP/BIP各2μmol和外引物?F3/B3各0.25μmol。

上述顯色液優(yōu)選為熒光染料?SYBR?Green?I或EvaGreen。

上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟油。

上述陽性對照為?CAMV35S?基因?DNA?片段。

本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的生產工藝

1、將內引物FIP/BIP和外引物?F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質檢；

2、將反應液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；

3、將穩(wěn)定液無菌分裝，抽樣質檢；

4、將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；