[發(fā)明專利]一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110003536.5
• 申請日: 2011-01-10
• 公開（公告）號: CN102154302A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 曹利平;丁國平;闕日升
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/866;C07K14/47;C07K1/36;C07K1/26;C07K1/20
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 冉國政

技術領域

本發(fā)明涉及一種MICA蛋白的制備方法，尤其是一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法。

背景技術

移植物發(fā)生免疫排斥反應是自器官移植出現(xiàn)后就一直困擾國內外學者的最大瓶頸，雖然移植免疫機制的研究在不斷深入，大量新免疫抑制藥物在不斷涌現(xiàn)，但是移植后移植物發(fā)生免疫排斥機率仍然較高，而使用免疫抑制劑卻費用昂貴，且長期應用免疫抑制劑還會大大增加后發(fā)生腫瘤、感染的機會，因此對移植免疫的研究依然是最關鍵的課題之一。

一直以來，學界都將研究重點放在了經(jīng)典的主要組織相容性復合體(major?histocompability?complex，MHC)方面，即MHC-I和MHC-II上，并建立了經(jīng)典的免疫排斥理論：即同種異基因個體間移植后，受者T細胞通過直接或間接兩條途徑，在協(xié)同刺激因子的作用下獲得激活，從而發(fā)動一系列免疫應答，且認為體液免疫是超急性排斥反應和加速急性排斥反應的主導機制；而急性排斥反應和慢性排斥反應主要由細胞免疫反應機制參與。因此以往在同種異體器官移植前往往需要進行供受體間的經(jīng)典MHC交叉配型（主要是HLA-A，HLA-B和HLA-DR）試驗，國內外的臨床實驗也證明了移植前經(jīng)典MHC交叉配型陰性的受者和交叉配型陽性的受者相比，前者在移植物免疫排斥發(fā)生率上明顯低于后者。但是后來有研究人員發(fā)現(xiàn)一些即使是經(jīng)典MHC交叉配型一致的受者在移植后，也不能完全避免急性或慢性免疫排斥反應的發(fā)生，在另外一些術前同樣經(jīng)過經(jīng)典HLA交叉配型，且抗HLA抗體檢測陰性卻依然發(fā)生了急性或慢性排斥反應的受體體內，發(fā)現(xiàn)了大量激活的NK細胞和T細胞，說明細胞免疫反應機制的存在。說明除了經(jīng)典的MHC分子，還存在其他引起細胞免疫反應的未知因素。

近些年來，國外一些學者在對MHC的外延性研究中發(fā)現(xiàn)了與經(jīng)典MHC基因有高度同源性的非經(jīng)典MHC-I類基因，其中以MICA基因(major?histocompatibility?complex?class?I?chain-related?gene?A，又稱為MHC-?I?鏈相關基因A)最為引人注目（Giurisato?E,?Cella?M,?Takai?T,?et?al.?PI3-kinase?activation?is?required?to?form?the?NKG2D?immunological?synapse.?Mol?Cell?Biol,?2007,?27:8583-99）。MICA基因與經(jīng)典HLA-I類基因具有較高的同源性，但功能不同。MICA基因位于HLA-B位點著絲粒端約46kb處，全長11722bp，比經(jīng)典HLA-I類基因長。其編碼產(chǎn)物是一條高度糖基化的蛋白質分子，結構與經(jīng)典的HLA-I類分子a鏈相似，包括3個胞外結構域：al、a2和a3，以及跨膜區(qū)和胞內區(qū)，構型很穩(wěn)定（見圖1和圖2）。MICA基因呈高度多態(tài)性，存在于人、靈長類、狗、羊、牛和豬中，主要表達于內皮細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞、上皮細胞以及多種腫瘤細胞，如肝癌、直腸癌、膠質瘤細胞表面。MICA蛋白?的功能是隨著其受體NKG2D及與NKG2D組成復合體DAP10的發(fā)現(xiàn)之后得到了解的。NKG2D是Ⅱ型C凝集素樣蛋白，表達于所有NK細胞，γδT細胞，CD8⁺?T細胞表面，MICA蛋白與NKG2D／DAP10結合后，可以將活化信號傳遞給NK細胞、γδT細胞等[Giurisato?E,?Cella?M,?Takai?T,?et?al.PI3-kinase?activation?is?required?to?form?the?NKG2D?immunological?synapse.?Mol?Cell?Biol,?2007,?27:8583-99]，可能有助于促進它們對表達MICA?蛋白的細胞的殺傷，參與免疫應答。

近來美國學者在一些腎移植術前和術后患者的血清中均發(fā)現(xiàn)了MICA抗體，隨后又在出現(xiàn)排斥反應被切除的移植腎中發(fā)現(xiàn)了更高滴度的該抗體，提示此類患者在腎移植前體內存在同種異型MICA抗原的預致敏，且MICA抗體在腎移植后發(fā)生的排斥反應中可能起著重要作用，但其參與免疫反應的機制仍然不清楚。另外，國外目前對MICA基因及其表達產(chǎn)物MICA蛋白的研究還主要集中在腎移植領域方面，而對于其他器官移植，如MICA蛋白對肝臟移植后免疫排斥反應的影響及其作用機理研究依然較少。