[發(fā)明專利]一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110003536.5
• 申請(qǐng)日: 2011-01-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102154302A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹利平;丁國(guó)平;闕日升
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/866;C07K14/47;C07K1/36;C07K1/26;C07K1/20
• 代理公司: 杭州裕陽(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 冉國(guó)政

1.一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟一：取正常健康成年志愿者捐獻(xiàn)的體外外周靜脈血30ml，先用生理鹽水稀釋后10倍，然后使用淋巴細(xì)胞分離液分離出灰白色淋巴細(xì)胞層，用PBS液對(duì)所述灰白色淋巴細(xì)胞層洗滌，在該過(guò)程中，使用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞活性；

步驟二：利用TRIZOL提取經(jīng)步驟一處理的灰白色淋巴細(xì)胞的RNA，利用PCR技術(shù)合成和擴(kuò)增特異性MICA基因片段，KpnI?和XboI限制性內(nèi)切酶切取所需要片段克隆入pEnter-3C質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)序列篩選后利用Baculovirus?Expression?System?and?Gateway技術(shù)直接植入桿狀病毒基因組內(nèi)，重組的桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染S9f昆蟲(chóng)細(xì)胞，收集病毒后放入無(wú)血清的EXPRESS?FIVE?SFM培養(yǎng)基中，3天后用50mM?Tris,?150?mM?NaCl,?pH?8.0.溶液透析，離心獲取上清后用鎳親和力瓊脂糖提取MICA蛋白，利用CENTRICON?超濾器過(guò)濾；

步驟三：目標(biāo)蛋白的純化

a.二維聚丙烯酰胺凝膠電泳：將目標(biāo)蛋白在IPG膠條上上樣，聚焦步驟后洗滌，加SDS還原劑，連接到SDS-PAGE平板凝膠中，并以考馬斯亮藍(lán)染色，切取寬約1mm的目標(biāo)蛋白條帶，用50%甲醛和10%醋酸進(jìn)行脫色及去除SDS；

b.串聯(lián)高效液相層析：與2D-SDS-PAGE相比，它利用不同分離模式的結(jié)合，使混合物中的肽得到更大程度的分離，并且降低低豐度肽的丟失；

步驟四：MICA目標(biāo)蛋白的鑒定：是MICA基因的特異性抗體，用Western?Blot對(duì)MICA基因的特異性抗體Mab?1.7A8進(jìn)行反向驗(yàn)證。