[發明專利]一種二氫鞘氨醇羥化酶基因及編碼的多肽

無效

• 申請號: 201110003398.0
• 申請日: 2011-01-10
• 公開（公告）號: CN102154335A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 呂杰;毛培宏;金湘;馬媛
• 申請（專利權）人: 新疆大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發明領域

本發明涉及微生物次生物質代謝技術領域。具體的說，本發明涉及一種涉及產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母二氫鞘氨醇羥化酶基因的克隆及編碼的多肽技術領域。

背景技術

麻黃堿(l-ephedrine)和偽麻黃堿(d-pseudo-ephedrine)是麻黃植物中生物堿類次生代謝產物，具有重要的藥用價值。麻黃堿和偽麻黃堿的生物合成由多基因控制，其代謝途徑的相關基因沒有任何相關信息，因此長久以來麻黃堿工業化生產主要依靠從天然植物麻黃中直接提取與化學合成兩種方法。

二氫鞘氨醇羥化酶(sphingosine?hydroxylase，簡稱SUR2)是真核生物中可將二氫鞘氨醇C4位羥基化催化產生植物鞘氨醇的酶。鞘氨醇作為真核細胞內的脂類信號分子，參與細胞內多種生理過程的信號傳導過程；參與脂質代謝途徑與真核生物細胞膜的合成相關，有維持細胞膜完整性的作用，并參與氨基酸的轉運和作為細胞膜上蛋白質的錨定位點等作用。目前二氫鞘氨醇羥化酶僅用于真核生物細胞膜合成以及細胞內信號物質傳導的研究。隨著生物技術和酶工業的發展，為獲得重組酵母菌合成麻黃堿時高表達二氫鞘氨醇羥化酶基因片段打好技術基礎。

發明內容

鑒于采用SSH技術分離獲得多條重組酵母菌合成麻黃堿時差異表達基因片段，其中高表達的二氫鞘氨醇羥化酶基因片段參與酵母麻黃堿生物合成代謝途徑的調控。因此，本發明旨在提供一種在產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母中高表達的二氫鞘氨醇羥化酶基因片段序列和編碼多肽序列，以應用于麻黃堿次生代謝途徑的研究，為麻黃堿代謝途徑基因在異常漢遜酵母中的整合、表達以及調控研究奠定基礎，也為二氫鞘氨醇羥化酶基因片段的相關研究領域提供新的基因資源。

本發明的技術方案：通過利用產麻黃堿的轉基因重組酵母是新疆大學利用離子束介導野生藍麻黃基因組DNA在異常漢遜酵母中的隨機轉化獲得重組酵母菌，相關方法和重組菌種已獲國家發明專利授權(專利號ZL?200610011402.7)。以出發菌株異常漢遜酵母2.340和重組酵母CGMCC?No.1499為研究材料，采用抑制差減雜交技術(suppression?subtraction?hybridization，SSH)獲得重組酵母生物合成麻黃堿時差異表達二氫鞘氨醇羥化酶基因片段，獲得二氫鞘氨醇羥化酶基因片段片段長438bp，通過美國國立生物技術信息中心序列相似性搜索程序(NCBI?Blast)的核酸序列分析，表明與數據庫中僅有的Pichia?ciferrii二氫鞘氨醇羥化酶基因同源部分相似性為88％。由此證明從產麻黃堿重組酵母中分離的二氫鞘氨醇羥化酶基因片段是一個新的二氫鞘氨醇羥化酶基因。

具體的，本發明提供了一種二氫鞘氨醇羥化酶基因的堿基序列全長為438bp，其編碼由序列表中SEQUENCE?LISTING所示的氨基酸序列中101個氨基酸組成的蛋白質。

同時，本發明提供了一種二氫鞘氨醇羥化酶基因片斷的獲得方法，所述的二氫鞘氨醇羥化酶基因SUR2是來源于產麻黃堿的轉基因重組酵母CGMCCNo.1499，通過SSH實驗獲得。具體包括如下步驟：

1.采用低能氬離子(Ar⁺)注入介導野生藍麻黃(Ephedra?glauca?L.)基因組DNA在異常漢遜酵母(Hansenula?anomala)中隨機轉化，轉化后的酵母菌通過目標性狀的篩選，獲得生物合成麻黃堿重組酵母菌株CGMCC?No.1499。