[發明專利]一種從動物肌肉中分離磷脂酶A2的方法

無效

• 申請號: 201110003353.3
• 申請日: 2011-01-10
• 公開（公告）號: CN102134564A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 王道營;張露娟;卞歡;劉芳;諸永志;徐為民
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所 32106
• 代理人: 江平

技術領域

本發明屬于農產品加工技術領域，涉及一種從動物肌肉中分離磷脂酶A₂的方法。

背景技術

磷脂酶A₂具有多種生物學功能，如脂質代謝、信號傳導以及消除炎癥等，其還與肌肉毒素、神經毒素和心臟毒素等有關，因此磷脂酶A₂的分離純化及其性質研究是醫學領域的熱點之一。同時因為磷脂酶A₂能夠催化水解甘油磷脂Sn-2位酯鍵生成溶血磷脂（溶血磷脂的潤濕能力、乳化穩定性等性能優于普通磷脂），所以磷脂酶A₂在多個產業領域（如食品、醫藥等）也有廣泛應用。

目前，國內外研究人員對蛇毒、蜂毒、豬胰和微生物中的磷脂酶A₂開展了大量的研究，其中對蛇毒中磷脂酶A₂的克隆、表達與晶體結構模擬等都已有詳細報道，另外對蜂毒磷脂酶A₂的DNA重組及結構也進行了研究，但這些酶基本都屬于低分子量分泌型酶，并且對動物源磷脂（如蛋黃卵磷脂）水解的效率普遍較低。

到目前為止，可的提取磷脂酶A₂量較少，不能滿足對高分子量細胞漿質型磷脂酶A₂純品的需要。

發明內容

本發明的目的是提供一種可大量獲取磷脂酶A₂的從動物肌肉中分離磷脂酶A₂的方法。

本發明方法步驟是：

1）取動物瘦肉組織剁碎后加入Tris-HCl緩沖液中勻漿，形成漿液；

2）在4℃的環境溫度下，將漿液離心，取上清液，然后在上清液中加入70%飽和度的硫酸銨進行鹽析，然后再在4℃的環境溫度下離心，將沉淀物用Tris-HCl緩沖液溶解，取得混合溶液；

3）將混合溶液置于透析袋中，在Tris-HCl緩沖液中進行去鹽透析，取得去鹽的透析物；

4）將去鹽的透析物在4℃的環境溫度下離心去除變性蛋白，取得磷脂酶A₂粗品；

5）用蛋白純化系統純化磷脂酶A₂粗品，得磷脂酶A₂純品；

其特征在于：所述步驟5）中，蛋白純化系統為：采用source?15Q、15×5.5?cm的離子交換柱，用pH為8.0、濃度為50mmol/L、流速為0.1mL/min?的Tris-HCl緩沖液平衡，待紫外吸收和電導基線穩定后，再用pH為8.0、含1mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液進行線性洗脫，控制NaCl的Tris-HCl緩沖液進入離子交換柱的流速為1.5mL/min，開始收集濾出液，當濾出液的NaCl濃度達到100%停止收集；將收集的濾出液進行超濾濃縮，取得磷脂酶A₂純品。

本發明采用從動物肌肉或加工后廢棄的瘦肉中提取高分子量細胞漿質型磷脂酶A₂純品，首先進行粗酶提取，然后使用離子交換柱對磷脂酶A₂進行純化。本發明可以滿足對高分子量細胞漿質型磷脂酶A₂純品的需要，同時對動物源磷脂（如蛋黃卵磷脂）的水解效率也比較高，從而彌補了目前常用磷脂酶A₂產品的不足。因此本發明在醫藥、食品、生化等領域具有廣泛的應用前景。

本發明采用離子交換法從動物肌肉中分離磷脂酶A₂，其優點在于：

（1）能夠獲得高分子量細胞漿質型磷脂酶A₂純品，普通的磷脂酶A₂分子量為12-18KD，而本方法所得的磷脂酶A₂分子量為201KD，可以滿足科研和生產中對該類磷脂酶A₂的需要。

（2）分離方法快速簡潔，蛋白純化只需經過離子交換柱即可完成。

（3）對蛋黃磷脂的水解效率高30.5%。以蛋黃卵磷脂為底物，25℃，普通磷脂酶A₂的活力為97.6μmol底物/h·g蛋白，而本方法所得的磷脂酶A₂的活力為127.37μmol底物/h·g蛋白。

附圖說明

圖1為磷脂酶A₂純化的離子色譜圖。

圖2?為本發明所得磷脂酶A₂的活性電泳圖。

圖3?為本發明所得磷脂酶A₂的酶解產物的薄層層析圖。

圖4為本發明所得磷脂酶A₂的酶解產物的氣相色譜圖。

具體實施方式