[發明專利]雙抗體夾心酶聯免疫分析試劑盒及其生產方法

無效

• 申請號: 201110002499.6
• 申請日: 2011-01-07
• 公開（公告）號: CN102175848A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 李學斌
• 申請（專利權）人: 武漢伊艾博科技有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 涂潔

技術領域

本發明屬于酶聯免疫分析(ELISA)技術領域，具體的說是一種雙抗體夾心酶聯免疫分析試劑盒及其生產方法。

背景技術

酶聯免疫分析法(又稱酵素免疫分析法，Enzyme-linkedimmunoassay，簡稱ELISA)是利用抗原抗體之間專一性鍵結之特性，對檢體進行檢測，主要以夾心法(sandwich)、間接法(indirect)、以及競爭法(Competitive)三種為主。

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的ELISA方法，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原的定量檢測，而不能用于小分子半抗原的檢測。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物。由于反應系統中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在方法可檢測范圍內)。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質量(OD值)，即可確定待測抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結合，則屬于雙位點夾心法。

雙抗體夾心法主要有三種，傳統的雙多抗夾心法(A法)所需檢測抗體和固相載體包被抗體都是多抗，制備簡單，在一定范圍內檢測靈敏度高，信號顯示強，很難避免鉤狀效應，其主要問題在于：固相載體上的抗體和檢測抗體都為針對完整抗原所有抗原結合位點多克隆抗體，抗原濃度比較低的時候，固相支持物上的抗體幾乎跟抗原上所有位點結合，結合力強，空余位點少，檢測抗體與抗原位點少，結合力弱，只要固相支持物上的抗體未與抗原結合飽和，抗原量與最后信號顯示部呈線性關系；隨著抗原量的增加，固相支持物上的抗體與抗原結合飽和，空余位點越來越多，檢測抗體與抗原的空余位點結合，信號顯示與實際抗原增長呈幾何倍數增長，同樣不呈線性關系；隨著抗原量的增加，固相載體上的抗體與每個抗原的結合位點很少，結合力很弱，而過量的檢測抗體與其結合位點增多，結合力增強，因為抗原抗體結合本來就是一個動態可逆的反應過程一旦從固相載體上抗體與抗原解離下來的時候，位點立即被檢測抗體結合，形成抗原抗體復合物沉淀，在洗滌過程中被洗掉，隨著抗原量的增加，而信號反而降低，就是所謂的鉤狀效應。此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此采用傳統雙多抗夾心法(A法)不適用于測定標本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液HCG等)。

用高親和力的單克隆抗體對(C法即檢測抗體和固相載體包被抗體都用單克隆抗體，)生產此類試劑盒可削弱鉤狀效應，由于固相載體上的抗體和檢測抗體結合的不是相同的位點，所以不形成競爭關系，一般情況下不會形成鉤狀效應，但是單克隆抗體制備周期長，成本高，特別是高親和力的配對抗體更是不容易得到，同時，由于固相載體上抗體和檢測抗體都是單位點與抗原結合，所以結合力弱，信號顯示值低，敏感性差，穩定性也不好。

針對上述問題，國外很多公司以單抗作包被抗體制備固相載體，以多抗作檢測抗體(B法)，由于抗原抗體結合位點競爭效應不強，不會產生鉤狀效用，檢測信號強度介于A法和C法之間，穩定性也介于A法和C法之間，但是該法需要生產至少一個單抗，生產周期長，成本高；但相對于C法而言，由于B法只需要生產一個單抗，并且不需要配對篩選，其成本和技術難度都相對較低。

發明內容

本發明的目的是為了解決上述技術問題，提供一種制備方法簡單、成本低、周期短的雙抗體夾心酶聯免疫分析試劑盒的生產方法。

本發明還提供一種由上述方法生產得到的檢測靈敏度高、誤差小、無標準曲線的鉤狀效應的雙抗體夾心酶聯免疫分析試劑盒。

一種雙抗體夾心酶聯免疫分析試劑盒的生產方法，包括以下步驟：

(1)抗原拆分：將含有兩個以上抗原表位的完整抗原拆分成兩個部分，每個部分為至少包含一個完整的有效抗原表位完全抗原；

(2)動物免疫及其檢測：將上述兩個完全抗原分別進行動物免疫，并采用酶聯免疫吸附分析法檢測動物免疫效果，分別得到兩份相應的ELISA效價不低于1∶100,000的動物免疫血清；

(3)親和層析提?。簩⑸鲜鰞煞輨游锩庖哐宸謩e通過完整抗原親和層析方法提取出兩份針對各自完全抗原的抗體；