[發明專利]篩選具有抗氧化作用的細菌的方法

無效

• 申請號: 201080060930.6
• 申請日: 2010-01-08
• 公開（公告）號: CN102858993A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 詹弗蘭科·格龍波內;瑪麗-克里斯蒂娜·德吉弗里;丹尼爾·拉蒙·維達爾;巴特里夏·馬托雷利·格羅拉;努里亞·岡薩雷斯·馬丁內斯;薩爾瓦多·赫諾韋斯·馬丁內斯;索菲·勒格蘭-拉斯波;伊莎貝爾·尚博;拉斐爾·布爾代-西卡爾
• 申請（專利權）人: 熱爾韋·達諾尼公司;佰歐波利斯有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;菅興成

技術領域

本發明屬于篩選具有抗氧化性質的食品級細菌的方法的領域。

背景技術

所有活體都在其細胞內保持還原環境。然而，由于線粒體的需氧代謝以及其他因素，產生了諸如過氧化物和氧自由基的活性氧源性物質。還原環境由諸如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的酶維持。如果正常的氧化還原狀態遭到破壞，活性氧物質可破壞包括蛋白質、脂質且尤其是DNA在內的所有細胞組分。活性氧物質的產生和去除活性中間體毒性或修復由活性氧物質引起的損害的能力之間的這種失衡，稱為氧化應激。在人體內，氧化應激是衰老以及與衰老有關的退行性疾病(例如癌癥、關節炎、糖尿病、動脈粥樣硬化、盧伽雷氏癥、帕金森氏病、心臟衰竭、阿爾茨海默病和亨廷頓氏病)的重要因素。衰老的自由基理論認為，生物體衰老是由于細胞隨時間累積了由活性氧物質引起的損害。

為了阻止氧化應激的有害作用，需要篩選具有抗氧化性質的膳食組分。特別地，食品級細菌，尤其是乳酸細菌是合適的抗氧化膳食組分，原因是它們的使用通過腸道定殖而有利地導致對抗氧化作用的長期作用。

US?6,884,415專利公開了通過使含具有超氧化物歧化酶(SOD)樣活性和過氧化氫酶(CAT)活性的植物乳酸桿菌(Lactobacillus?plantarum)的食品在含錳的天然物質存在下發酵而生產的抗氧化食品。然而，已知包括乳酸細菌在內的食品級細菌可以具有不依賴于過氧化氫酶或SOD活性的抗氧化性質。

國際申請WO?03/002131公開了發酵乳酸桿菌(Lactobacillus?fermentum)菌株作為抗氧化益生菌。該菌株的抗氧化性質通過體外的酶促試驗和通過測定谷胱甘肽還原/氧化電位而表征。

WO?00/20013國際申請公開了乳酸桿菌屬(Lactobacillus)或丙酸桿菌屬(Propionibacterium)菌株，其在哺乳動物的腸內產生數量提高的丙酸，用于制造降低諸如IL-6、活性氧物質和粘附分子的氧化應激因子的藥物。

秀麗隱桿線蟲(C.elegans)是自由生長的透明線蟲(線蟲類)，其生長在溫和的土壤環境中。秀麗隱桿線蟲以細菌，尤其是大腸桿菌(Escherichia?coli)OP50菌株為食，其由于多種原因而已被廣泛用作模型生物。秀麗隱桿線蟲株廉價，易于培養，并可以冷凍，且在隨后被解凍時仍保持存活而便于長期儲存，其具有短且可再生的壽命。秀麗隱桿線蟲具有作為足夠簡單的多細胞真核生物而進行非常細致的研究的優勢。該類線蟲在整個基因組中具有接近40%的人垂直同源基因，這使得其成為與人類狀況相關的生物。

秀麗隱桿線蟲已經用作評價氧化損傷和對衰老的影響的動物模型系統(Larsen,1993,PNAS?90:8905-8909)。該研究利用與其親本株相比對氧化應激具有高度抗性的突變株展開。

此外，Ikeda等人(2007,AEM?73:6404-6409)已經研究了乳酸細菌對秀麗隱桿線蟲壽命及其沙門氏菌屬（Salmonella）抗性的影響。作者認為，秀麗隱桿線蟲可能是用于篩選益生菌菌株(當攝入足量時對人的健康產生有益作用)或膳食性抗衰老物質的合適模型。然而，在該研究中并沒有評價對氧化應激的抗性。還已知，秀麗隱桿線蟲的壽命提高與胰島素通路有關，且與人體內涉及胰島素樣生長因子和糖尿病的垂直同源基因有關(Glenn等人，2004,J?Gerontol?A?Biol?Sci?Med?Sci.59:1251-1260)。

發明內容

本發明的發明人發現，秀麗隱桿線蟲動物模型系統是用于篩選食品級細菌對抗氧化應激損害作用的能力的合適模型。所述篩選試驗可以在其中加入了細菌的含液體培養基的微滴定平板中進行，也可以在具有所飼喂的細菌菌苔的瓊脂平板上進行。

特別地，可以利用秀麗隱桿線蟲測試這些食品級細菌對氧化應激、尤其是氧化活性物質形式的氧化應激引起的損害的預防作用。發現對秀麗隱桿線蟲施加氧化應激的合適方式是加入過氧化氫。本發明的篩選方法相對簡單，然而所獲得的結果與人類狀況有關。最后，有利的是，所述方法可以篩選具有整體抗氧化應激作用的食品級細菌菌株，而不像現有技術那樣受到抗氧化作用涉及的特定機制，例如特定酶的存在(例如CAT、SOD)或特定因子的釋放的選擇的限制。

具體實施方式

使用秀麗隱桿線蟲的篩選方法

本發明的一個實施方式涉及篩選具有抗氧化性質的食品級細菌的方法，所述方法包括：