[發明專利]通過口服施用重組乳酸乳球菌微型膠囊的免疫保護方法

有效

• 申請號: 201080058158.4
• 申請日: 2010-12-23
• 公開（公告）號: CN102665422A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 林文傑;徐宇虹
• 申請（專利權）人: 疫苗基因集團
• 主分類號: A01N63/00
• 分類號: A01N63/00
• 代理公司: 北京天悅專利代理事務所(普通合伙) 11311
• 代理人: 田明;任曉航

此申請要求美國序號61/289，663，（提交于2009年12月23日）的優先利益及國際申請號PCT/US2010/041792（提交于2009年12月23日）的優先利益，所有內容及披露皆被參考納入此申請。

技術領域

本發明大致涉及接種疫苗。在一個實施例，本發明提供了使用轉基因的乳酸乳球菌種作為口服疫苗的成分和方法。

背景技術

高致病性禽流感H5N1病毒被認為對全球人類和動物健康構成巨大威脅。這種病毒極易發生抗原漂移，并已經在人類對象引起多次具有非常高死亡率的爆發（1）。接種疫苗被認為是防止病毒的蔓延及迅速變異最可取的抵抗方法。為所有受影響的物種發展疫苗來放慢跨物種傳播也是非常可取的。然而，因為制造困難和一般要求對每個受試者多次注射，傳統使用滅活病毒制成的流感疫苗幾乎無法用于H5N1品種（2、3）。新的疫苗制劑，包括各種亞單位疫苗（4）、DNA疫苗（5、6）和重組腺病毒疫苗（7、8）現正被研究；但他們都因需要使用注射法而將不可能用于野生鳥類，而對人類和農場動物則既昂貴又麻煩。在這方面，安全和有效的口服疫苗將是理想的；因為它們可以添加到接種對象的食品或飲料內。

安全、有效、方便使用的食用疫苗已被追求了很長時間。使用可食用的植物如番茄、馬鈴薯來表達抗原，以供人類和牲畜口服免疫接種先前已提出（9-11）。最近，大米被用作抗原的表達和運載工具，并發現在小鼠中傳遞預防霍亂的免疫力（12）。使用食用植物作疫苗的表達和運載工具為多種傳染病提供了許多優點，尤其是那些病原體相對保守的疾病。這是因為通常需要1年以上才能生產表達穩定的轉基因植物。相比之下，傳染病毒迅速變異或轉移的疾病如流感病毒，同時可食用及能在幾周內改造的表達工具則更可取。為這個主要原因而選定了乳酸菌（LAB）：它一般被視為安全（GRAS）而又被廣泛食用或在食品中使用。使用重組乳酸乳球菌及各種抗原編碼為口服藥的研究中曾報告這種方法（13-16），繼而產生的各種免疫反應被認為與抗原類型、抗原表達量和抗原在腸道中表達時間相關（17、18）。

發明內容

發展安全和有效的流感疫苗供人類和動物使用是防止致命爆發和全球流感大流行的必要條件。本發明發現表達禽流感HA基因的轉基因乳酸菌如乳酸乳球菌種，可作為口服疫苗用以保護H5N1禽流感病毒的感染。

在這項研究中，在精心設計的乳酸鏈球菌素A-誘發表達的乳酸乳球菌種的基礎上，構建了若干個H5N1流感血凝素（HA）抗原表達載體。它們或在細胞質中表達抗原（L2）、或分泌抗原（L3）、或在細胞壁上展示抗原（L4）。在一個實施例，這些載體是用粘膜粘附聚合物和表面腸溶包衣制定成使用形態。在分別口服了有腸溶包衣的展示抗原的表達載體和分泌抗原的表達載體后，大大提高了所產生的免疫反應，引致已接種的小鼠在一個致死劑量的病毒挑戰下完全地受保護。

在一個實施例，受試者口服在此披露的轉基因乳酸乳球菌種后，誘導了強烈HA特異的體液免疫和粘膜免疫反應使其能承受致死劑量的H5N1病毒感染。

附圖說明

圖1顯示了重組乳酸乳球菌載體的免疫印跡分析（A、B和C）及L4的免疫熒光分析（D）（200倍）。

圖2顯示了酶聯免疫吸附試驗法檢測的HA特異性抗體滴度。使用腸溶膠囊和非腸道活菌為小鼠（2A及2B）口服免疫接種。（A）以重組HA蛋白作為包被抗原，使用親和素生物素系統-酶聯免疫吸附試驗測定HA特異性血清免疫球蛋白G。（B）由糞粒測定HA特異的粘膜免疫球蛋白A。（C）使用口服或皮下注射法以L4向雞免疫接種。使用親和素生物素系統-酶聯免疫吸附試驗測定雞血清免疫球蛋白G。*代表相對PBS、L1和膠囊-L1對照的顯著統計學差異。（*p<0.05）。數據為一式兩份實驗的平均值正負標準偏差。

圖3顯示了由有腸溶包衣的重組乳酸乳球菌所誘導的細胞介導免疫反應。*代表相對PBS、L1和膠囊-L1對照的顯著統計學差異。表示的數據為一式三份實驗的平均值正負標準偏差。

圖4顯示了口服傳遞不同的疫苗制劑后對H5N1禽流感病毒致命挑戰的免疫保護。最終免疫接種后2周，在鼻腔內以H5N1禽流感病毒感染小鼠。（A）感染后6天小鼠的平均體重損失（%）。（B）感染后0-14天存活小鼠的百分率。N=每組5只小鼠。

具體實施方式

應使用下列術語來形容本發明。在本文沒有作具體限定下，用于描述本發明的術語應給予本領域內普通技術人員所理解的一般意思。

在本文內，“食用疫苗”一詞是指通過口服途徑服用和生效的疫苗配方。