[發(fā)明專利]用于轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的改進(jìn)技術(shù)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080057861.3
• 申請(qǐng)日: 2010-12-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102791865A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P·本多克;B·G·J·菲倫斯-翁斯滕克;F·呂西耶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 凱津公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京戈程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

1.用于向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中引入一種或多種感興趣的分子的方法，其包含如下步驟

-通過(guò)酶降解和/或從植物細(xì)胞中移除細(xì)胞壁來(lái)提供植物細(xì)胞原生質(zhì)體；

-進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第一轉(zhuǎn)染，所述轉(zhuǎn)染采用

i.能夠改變選自錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)、非同源性末端連接的一種或多種通路的調(diào)節(jié)的第一組合物；和/或

ii能夠誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的第二組合物，

-采用一種或多種感興趣的分子進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第二轉(zhuǎn)染；

-允許細(xì)胞壁形成；

其中第二轉(zhuǎn)染在第一轉(zhuǎn)染之后進(jìn)行。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中能夠誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的第二組合物選自鋅指核酸酶、大范圍核酸酶或TAL效應(yīng)子核酸酶、編碼鋅指核酸酶的DNA構(gòu)建體、編碼大范圍核酸酶的DNA構(gòu)建體、編碼TAL效應(yīng)子核酸酶的DNA構(gòu)建體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中第一組合物和第二組合物基本上同時(shí)提供給植物細(xì)胞原生質(zhì)體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中第一組合物在第二組合物之前加入。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中第二組合物在第一組合物之前加入。

6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項(xiàng)所述的方法，其中調(diào)節(jié)的改變是一種或多種通路的下調(diào)，優(yōu)選通路的瞬時(shí)下調(diào)。

7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包含采用抑制或阻止細(xì)胞壁（再）形成的非酶組合物接觸植物細(xì)胞原生質(zhì)體

-在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)；或

-介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，或

-在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)；或

-在第二轉(zhuǎn)染之后，

并且所述方法進(jìn)一步包含移除抑制或阻止細(xì)胞壁形成的非酶組合物的步驟：

-在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)，或

-介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，或

-在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)，或

-在第二轉(zhuǎn)染之后，

并且在允許細(xì)胞壁形成之前。

8.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包含同步植物細(xì)胞或植物細(xì)胞原生質(zhì)體的細(xì)胞周期時(shí)相的步驟。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中同步通過(guò)采用同步化劑接觸植物細(xì)胞或植物細(xì)胞原生質(zhì)體來(lái)完成，優(yōu)選

-在由植物細(xì)胞形成植物細(xì)胞原生質(zhì)體之前或與其同時(shí)；或

-在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)；或

-在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)；或

-介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包含移除同步化劑的步驟：

-在由植物細(xì)胞形成植物細(xì)胞原生質(zhì)體之前；或

-在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)；或

-在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時(shí)；或

-介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間；或

-在第二轉(zhuǎn)染之后或與其同時(shí)。

11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任意項(xiàng)所述的方法，其中同步步驟與采用抑制或阻止細(xì)胞壁（再）形成的非酶組合物接觸植物細(xì)胞原生質(zhì)體的步驟獨(dú)立地（如在其之前、在其之后或與其同時(shí)）進(jìn)行。

12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中抑制細(xì)胞壁形成的非酶組合物含有一種或多種細(xì)胞壁形成抑制劑，所述細(xì)胞壁形成抑制劑選自

a.纖維素生物合成抑制劑；

b.微管裝配抑制劑；

c.纖維素沉積抑制劑；

d.其它細(xì)胞壁形成抑制劑。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中纖維素生物合成抑制劑選自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺、多沙唑啉A、多拉霉素、沙司多素A、布雷菲德菌素A。

14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中微管裝配抑制劑選自柯多素、二硝基苯胺、氟草胺（乙丁氟靈）、丁樂(lè)靈、敵樂(lè)胺、乙丁烯氟靈、安磺靈、二甲戊樂(lè)靈、氟樂(lè)靈、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺=拿草特、牧草胺DCPA（氯酞酸二甲酯）。

15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中纖維素沉積抑制劑是二氯喹啉酸。