[發明專利]用于轉染原生質體的改進技術

有效

• 申請號: 201080057861.3
• 申請日: 2010-12-20
• 公開（公告）號: CN102791865A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: P·本多克;B·G·J·菲倫斯-翁斯滕克;F·呂西耶
• 申請（專利權）人: 凱津公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術領域

本發明涉及用于向植物細胞原生質體中引入感興趣的外來分子的方法。本發明還涉及轉染的植物細胞原生質體和用于實施所述方法的試劑盒。

背景技術

遺傳改造是刻意創造活細胞遺傳物質變化的方法，所述方法目的在于改造那種細胞或者由細胞構成其一部分的器官或由細胞再生的器官的一種或多種遺傳編碼的生物學屬性。這些變化可以采取刪除部分遺傳物質、加入外源性遺傳物質或者像遺傳物質中現有核苷酸序列的替換的變化的形式。

用于真核生物遺傳改造的方法為人們所知已超過20年，并且已發現其廣泛應用于植物和動物細胞和微生物以改善農業、人類健康、食品質量和環境保護領域。

遺傳改造的常見方法由向細胞基因組中加入外源性DNA片段組成，然后這將賦予那種細胞或其有機體除了通過已經現有的基因編碼的屬性以外的新的屬性(包括其中現有基因的表達將因此被抑制的應用)。盡管很多這樣的實例可以有效地獲得所需的屬性，但是這些方法不是非常準確，因為無法控制外源性DNA片段插入其中的基因組位置(并因此無法控制最終的表達水平)，并且因為所需的效果將其自身體現在由原始的且均衡的基因組編碼的自然屬性之上。遇到的一個常見問題是，由于外源性DNA片段在宿主基因組DNA中的隨機整合，必要或有利的基因被失活或修飾，造成宿主所需特征的不必要的損失。

相反，將導致預定義的基因組基因座中核苷酸的加入、刪除或轉化的遺傳改造的方法將允許現有基因的精確改造。

隨著過去十年里基因組學的出現，現在有可能迅速且成本有效地地破譯動物、植物和細菌的基因組。這已經導致大量的能夠與如動物的疾病易感性或植物的產量特征的表型有關的基因和調節序列。這將允許迅速建立序列的假定功能，但是一個基因對一種觀察到的表型負責的最終證明必須通過創建顯示預期的改變的表型的突變系來獲得。

不同于動物細胞，植物細胞由多糖和蛋白質的混合物組成的厚厚的細胞壁包圍，而動物細胞可以輕易地服從外來分子的引入，植物細胞更加頑固并且需要稍微更加侵略性的方法。為了向植物細胞中引入外來分子的現有技術程序可以分為2種類別。

第一類重組了采用通過刺穿植物細胞壁向植物細胞中機械引入感興趣的分子的所有方法。這能夠通過生物彈道遞送(biolistics?delivery)來完成，其中將感興趣的分子包被在金屬珠(金或鎢)上，使用氣體加壓裝置將其推進到細胞中。然而，這種方法的效率相當低并且因為不是所有的細胞都被轉化，選擇是必須的，其限制了目標的數目。另一種方法使用了連接到一個微型操縱器上的微-或納-針將化合物穿過細胞壁直接注射到植物細胞中。然而，微注射需要特殊設備和大量技巧。該方法同樣是單調的和費時的并且相較于生物彈道遞送幾乎沒有提供優勢。但另一種方法使用了碳納米管，其含有感興趣的分子并且其末端包被有細胞壁消化酶。據說，納米管將局部地降解細胞壁并刺穿質膜允許其內容物遞送進入宿主細胞。雖然與微注射或生物彈道轟擊(biolistics?bombardment)相比侵略性較低，上述限制也適用于此。

第二類重組了其中在引入感興趣的分子之前用酶將整個植物細胞壁移除的所有方法。細胞壁的完全移除破壞了細胞之間的聯系，產生了個體化細胞的均勻混懸物，其允許更均勻和更大規模的轉染實驗。這包括，但不僅限于，原生質體融合、電穿孔、脂質體介導的轉染和聚乙二醇介導的轉染。因此，原生質體的制備是一種產生數百萬細胞的非?？煽亢土畠r的方法，并且由于其靈活性、效率和產量，通常比其它方法優選。

幾乎能夠從每一種植物組織中分離原生質體。原生質體的主要來源是葉肉組織，其每克鮮重產生大量的原生質體。其它組織類型的使用主要取決于現有程序對于所考慮的系統和實驗最終目標的可用性。