[發明專利]用于擴增靶核酸的方法

有效

• 申請號: 201080055136.2
• 申請日: 2010-12-03
• 公開（公告）號: CN102639718A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 奧洛夫·艾瑞克森;馬格納斯·伊薩克森;亨瑞克·約翰森;弗雷德里克·羅斯;西蒙·弗雷德里克松;馬茲·尼爾森
• 申請（專利權）人: 哈羅基因公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司 11258
• 代理人: 李劍

本發明涉及用于擴增在核酸樣品中存在的靶核酸的改進方法。在此類方法中，將樣品片段化并且將含有靶核酸的片段(“靶片段”)與提供的探針雜交，所述探針含有與靶片段互補的序列，排列為在雜交時使得靶片段采用環形構象。探針被固定在固相上，便于在探針-靶片段雜交中的靶片段的連接-介導的環化之前進行去除非靶核酸的分離步驟。接著擴增環化的靶片段，并且可通過例如核酸測序、微陣列、qPCR等等對擴增產物進行隨后的分析。本發明特別涉及這樣的改進，其中雜交步驟和連接步驟被分開，并在分立的步驟中、在分開的溶液中進行，允許例如，在連接之前分離并去除未雜交的片段和核酸。本發明的方法特別適合核酸的多重靶向擴增。

通常期望能選擇性多重擴增許多感興趣的基因組區，例如為了分析在生理或病理狀況中的牽涉的候選區域。特別地，伴隨著下一代平行測序技術的出現，為了克服基因組分析中由于聚合酶鏈式反應(PCR)對于高多重擴增的不適宜性導致的瓶頸，需要允許即時制備感興趣大的基因組區樣品的方法。充分開發下一代測序器的測序通量的成本有效的靶向重測序需要能特異性平行擴增大量的靶基因組序列的方法。

從WO?99/49079中可知，一種用于從核酸樣品中擴增靶核酸的不依賴于PCR的方法是使樣品片段化以生成含有靶核酸的片段并且通過將片段與下述的線性寡核苷酸探針雜交使片段環化，所述探針被設計以含有分別與片段的5′和3′末端序列互補的相鄰序列。探針可被固定化。通過相鄰雜交的末端的連接，片段隨后被環化，并且接著通過滾環擴增(RCA)被擴增。但是，WO?99/49079中沒有公開此類方法的多重實施方式。

WO?01/38580公開了固定化的“錨定引物”，其可使靶核酸環化用于隨后例如通過RCA的擴增。

在WO?2005/111236中公開用于從核酸樣品中多重擴增靶核酸的溶液相(非固定化探針)方法。在該方法中，具有在雙鏈部分側翼的單鏈末端的部分雙鏈探針通過它們的單鏈末端以靶特異性方式與從核酸樣品的片段化產生的靶片段的兩個末端都雜交。連接步驟導致探針-靶片段雜交體環化。探針的雙鏈區(其一個鏈形成環化的探針-靶片段雜交體的部分)含有引物對基元，所述引物對基元對于在多重檢驗中使用的許多不同的靶-特異性探針是相同的。因此，多種靶片段的PCR擴增可同時實現，同時避免由于使用多種不同的引物對而可能導致的擴增假象(artefacts)。

現已令人吃驚地發現，通過在靶片段與探針的雜交和隨后的連接(環化)之間進行分離步驟，在分別使用如在WO?99/49079或WO?2005/111236中描述的單鏈或部分雙鏈探針的方法的情況下，可實現出乎意料的良好結果。在分離步驟中，探針-靶片段雜交體被從樣品中特別是從未雜交的片段或其他核酸中分離。此種效果是不可預見的。通常不會預見到通過在連接步驟之前(即在雜交后并且在連接前)分離探針靶片段雜交體與通過在連接步驟后分離相比將使得所述方法獲得的結果差異顯著。的確，如果預見在此類方法的步驟順序中分離步驟的位置將具有重要作用，考慮到靶片段與通過連接而被穩定的探針的結合，在連接步驟之后分離將是有利的。特別地，如果探針被固定，這將導致被穩定的靶片段的固定，因而提高其與未非特異性固定的核酸的分離。事實上，已令人吃驚地發現，相反是正確的；當雜交步驟和連接步驟被分離步驟分開(即在連接之前分離)時獲得的結果顯著好于無分離步驟或分離步驟在連接步驟之后時獲得的結果。

不希望受理論束縛，我們相信，若未由連接之前的分離步驟去除，非靶“背景(background)”核酸片段分子間或分子內連接為容易擴增的線性多連體分子或環形分子。經歷連接后分離步驟留下來的任何此類分子引起擴增步驟期間高水平的背景擴增。可以認為，通過在連接前將靶(探針雜交的)片段與非靶片段分離，分離步驟后在固相上剩余的任何非靶片段由于它們的低濃度和/或由于它們與固相附接導致的空間位阻而具有低的連接概率。此類片段較低的連接成容易擴增種類的水平導致背景擴增的水平顯著降低。

因而，本發明提供用于擴增核酸樣品中的至少一種靶核酸的方法，其包括：

(a)使核酸樣品片段化，以產生至少一種靶片段，所述靶片段包含所述靶核酸并包含兩個探針互補部分，其中所述兩個探針互補部分的至少一個位于靶片段的末端；

(b)使所述片段化的核酸樣品與至少一種探針接觸，所述探針具有固定化部件并任選地通過所述部件被固定在固相上，并且所述探針包含與靶片段的探針互補部分在序列上互補的兩個靶片段互補部分，其中探針的所述部分可以是緊鄰的，或被中間非靶片段互補部分分開；