[發明專利]用于擴增靶核酸的方法

有效

• 申請號: 201080055136.2
• 申請日: 2010-12-03
• 公開（公告）號: CN102639718A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 奧洛夫·艾瑞克森;馬格納斯·伊薩克森;亨瑞克·約翰森;弗雷德里克·羅斯;西蒙·弗雷德里克松;馬茲·尼爾森
• 申請（專利權）人: 哈羅基因公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司 11258
• 代理人: 李劍

1.用于擴增核酸樣品中的至少一種靶核酸的方法，其包含：

(a)使所述核酸樣品片段化，以產生至少一種靶片段，所述靶片段包含所述靶核酸并包含兩個探針互補部分，其中所述兩個探針互補部分的至少一個位于所述靶片段的末端；

(b)使所述片段化的核酸樣品與至少一種探針接觸，所述探針具有固定化部件并任選地通過所述部件固定在固相上，并且所述探針包含與所述靶片段的所述探針互補部分在序列上互補的兩個靶片段互補部分，其中所述探針的所述部分可以是緊鄰的，或可被居間非靶片段互補部分分開；

(c)使所述片段化的核酸樣品成為單鏈的，其中所述步驟可在步驟(b)之前、與步驟(b)同時或在步驟(b)之后發生；

(d)允許所述靶片段的所述探針互補部分與所述探針的所述靶片段互補部分雜交；

(e)如果在步驟(b)中提供的所述探針未被固定化，通過所述固定化部件使所述探針-靶片段雜交體固定在固相上；

(f)將未固定的核酸片段與所述固相分離；

(g)使所述固相與連接酶接觸，以直接或間接連接所述靶片段的可連接的5′和3′端，由此環化所述靶片段，其中如果所述靶片段的所述探針互補部分之一沒有位于所述靶片段的末端，通過瓣狀內切核酸酶或外切核酸酶的作用生成除探針互補部分所位于的末端之外的另一所述可連接末端；和

(h)擴增所述環化的靶片段。

2.根據權利要求1的方法，用于擴增核酸樣品中的多種靶核酸，其中在步驟(b)中將所述片段化的核酸樣品與多種探針接觸。

3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述核酸樣品包含DNA。

4.根據權利要求1至3任一項所述的方法，其中所述核酸樣品包含基因組DNA或其子級分。

5.根據權利要求1至4任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述片段化通過一種或多種限制性核酸內切酶的方式。

6.根據權利要求1至5任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述片段化通過如下進行：將所述核酸樣品的多份小份試樣分別經受一種或多種限制性核酸內切酶的各不同的組合，并在步驟(b)之前合并片段化的核酸樣品的所述小份試樣。

7.根據權利要求1至6任一項所述的方法，其中兩個探針互補部分都位于所述靶片段的末端。

8.根據權利要求1至7任一項所述的方法，其中所述固定化部件是生物素部件。

9.根據權利要求1至8任一項所述的方法，其中所述固相攜帶一個或多個抗生蛋白鏈菌素部件。

10.根據權利要求1至9任一項所述的方法，其中所述固相包括磁性珠粒。

11.根據權利要求1至10任一項所述的方法，其中探針-靶片段雜交體在步驟(e)中固定在固相上。

12.根據權利要求1至11任一項所述的方法，其中在步驟(b)中所述至少一種探針的與所述靶片段的探針互補部分互補的所述靶片段互補部分由居間非靶片段互補部分分開，并且所述方法還包括使所述片段化的核酸樣品接觸與所述居間部分互補的缺口寡核苷酸。

13.根據權利要求12所述的方法，其中所述缺口寡核苷酸含有一種或多種擴增引物結合序列。

14.根據權利要求12或權利要求13所述的方法，其中所述缺口寡核苷酸含有一種或多種條形碼序列，所述方法還包含在步驟(g)之后將所述環化的靶片段與從其他樣品產生的環化的靶片段合并，并使所述合并的環化的靶片段經受步驟(h)。

15.根據權利要求1至14任一項所述的方法，其中在步驟(c)中通過熱變性的方式使得所述片段化的核酸樣品成為單鏈的。

16.根據權利要求1至15任一項所述的方法，其中在步驟(d)中使得所述靶片段的探針互補部分在甲酰胺存在的情況下與所述探針的靶片段互補部分雜交。

17.根據權利要求1至16任一項所述的方法，還包括在步驟(f)和(g)之間的一個或多個洗滌所述固相的步驟。

18.根據權利要求17所述的方法，其中所述洗滌步驟在存在甲酰胺的情況下進行。