[發明專利]未甲基化核酸的選擇性積累

在審

• 申請號: 201080054931.X
• 申請日: 2010-11-23
• 公開（公告）號: CN102639717A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 克里斯蒂安·科哈格;安德烈亞斯·梅爾
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;謝麗娜

技術領域

本發明屬于生物學和化學領域，更具體來說屬于分子生物學領域。具體來說，本發明涉及核酸的未甲基化區域的擴增和核酸中甲基化模式的分析。

發明背景

甲基化是DNA的常見化學修飾，其中甲基被轉移到核苷酸堿基上，例如胞嘧啶的嘧啶環的5位碳處。這一般通過特定的DNA甲基轉移酶從頭形成或在例如DNA復制期間維持已有的甲基化模式而發生。

DNA甲基化可以具有多種功能：例如，它可以被原核生物用來將內源DNA與導入到原核生物中的外來DNA區別開。此外，除了其他功能之外，它還在原核生物DNA合成期間的錯誤校正中發揮重要作用，使得原始（模板）鏈與新合成的鏈區分開。許多原核生物具有在特定信號序列處或附近對內源DNA進行甲基化的DNA甲基轉移酶。在這些生物體中，外來的未甲基化DNA可以被特異性甲基化敏感性限制性內切核酸酶在信號序列處或附近切開，并由此降解。

除了上面提到的只切開未甲基化區域的甲基化敏感性內切核酸酶之外，還存在甲基化依賴性內切核苷酸，其只在特定甲基化序列處或緊挨所述序列切開。

在真核生物中，DNA的甲基化提供了另一層信息，例如允許將基因組的活性區域與無活性區域區分開。甲基化模式在特別是差異基因表達中具有特殊作用，并因此也與腫瘤發生相關。

本技術領域的專業人員已知有多種來自于現有技術的方法可用于獲得關于DNA中的甲基化模式的信息：例如在亞硫酸鹽測序中，首先將待分析的DNA與亞硫酸鹽反應以使未甲基化的胞嘧啶轉變成尿嘧啶，然后利用PCR進行擴增并進行DNA測序。從亞硫酸鹽處理和未亞硫酸鹽處理的DNA之間的序列差異，可以推斷出隱含的甲基化模式。或者，也可以使用甲基化特異性引物、即與未轉變的序列互補的引物，利用甲基化特異性PCR（MSP）來分析亞硫酸鹽處理過的DNA。作為亞硫酸鹽技術的替代方案，可以使用其他方法例如甲基化特異性限制性分析或甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。

這些方法的目標是限定序列區域的甲基化分析和限定序列區域的甲基化程度定量。

發明描述

本發明提供了可用于確立DNA的整體甲基化模式的方法。因此，本發明的方法的目標主要是鑒定含有甲基化區域的基因組區段。在特別優選的實施方案中，本發明的目標是鑒定含有甲基化區域的基因組區段，而不是測定具體各個堿基的甲基化狀態。

使用本發明的方法，也可能執行未甲基化DNA的選擇性制備。

方法由幾個子步驟組成：

（1）將DNA、優選為基因組DNA用甲基化依賴性核酸酶消化。

（2）在消化后，利用擴增方法、優選為隨機引發的序列擴增方法來復制DNA，因此只有未甲基化的DNA區段、即沒有被切開的那些區段，可以被復制。擴增的結果是復制的DNA不含較早時被甲基化依賴性核酸酶切開的那些區段。因此，該方法引起未被甲基化的序列部分的選擇性積累和復制。

（3）任選地，隨后可以對按照方法選擇和擴增的DNA中的序列區段的拷貝數執行定量分析。

后者可用于分析DNA或其子區段的甲基化模式，即DNA或其限定部分最初被甲基化的程度。

因此，本發明的方法與用于分析核酸甲基化的其他方法互補。

本發明的方法可以幫助鑒定被甲基化的基因組區段。通過擴增所選序列，該方法允許在不必了解準確甲基化位點的情況下進行整體甲基化分析。

因此，本發明提供了用于對DNA的未甲基化序列進行選擇性擴增的方法，所述方法包含下列步驟：

（i）提供包含在至少一個位點處被甲基化的DNA的樣品，

（ii）用甲基化依賴性核酸酶處理樣品中的DNA，以及

（iii）使用甲基化依賴性核酸酶對切開的DNA進行擴增。

步驟（ii）和（iii）可以同時或相繼執行。