[發明專利]DNA構建體以及用其制備重組CHO細胞的方法

無效

• 申請號: 201080054560.5
• 申請日: 2010-09-21
• 公開（公告）號: CN102639699A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 曾根崎修司;大神有美;山名良正;成田純也
• 申請（專利權）人: TOTO株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C07K16/00;C12N5/10
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉華聯

技術領域

本發明涉及一種用于高效制備重組CHO細胞的DNA構建體，以及用其來制備重組CHO細胞的方法。

背景技術

各種使用原核生物或真核生物作為宿主細胞的重組蛋白生產系統是公知的。在利用哺乳動物細胞作為宿主細胞的重組蛋白生產系統中，來自包括人類的高等動物的蛋白可以與其在體內合成類似的方式進行翻譯后修飾，例如糖基化、折疊以及磷酸化。

翻譯后修飾是利用重組蛋白質進行天然蛋白生理活性的復制所必須的，并且利用哺乳動物細胞作為宿主的蛋白質生產系統普遍用于在特別需要具有這種生理活性的藥物中所使用的重組蛋白生產系統。

目前，兩種蛋白生產系統即CHO-DHFR系統和GS-NS0系統可稱作使用能用于大規模生產的哺乳動物細胞的主蛋白生產系統。在這些生產系統中，通過將質粒載體內所含的選擇性標記與合適的藥物選擇方法相結合來篩選可以實現整合到染色體中的質粒載體拷貝數增加的克隆。尤其是，在CHO-DHFR系統中，其表達水平增大了幾十倍的細胞克隆可以使用選擇性藥物甲氨蝶呤通過兩段篩選法來進行篩選。

然而眾所周知，上述蛋白生產系統存在著問題，例如，靶蛋白的表達水平并不僅僅總是隨著擴增質粒載體的拷貝數量而按比例增加，而是需要花大量的時間來篩選表達水平提高的細胞克隆。此外，據報道，當在對表達水平提高的細胞克隆進行篩選之后在沒有選擇性藥物存在的培養基中繼續培養所選出的細胞克隆時，在大多數的克隆中可以觀察到表達水平的降低或消失（PTL?1：JP?2002-541854T；NPL?1：Kim,N.S.(1998)Biotechnol.Bioeng.,60,679-688）。

此外，在采用哺乳動物細胞的靶蛋白生產系統中，在一般情況下，通過將含有靶蛋白基因的載體導入到宿主細胞中、篩選其中載體已整合到染色體中的細胞克隆，并且進一步在合適的培養條件下培養宿主細胞，從而來生產靶蛋白。

整合到染色體中通常發生在隨機的位置處，并且靶蛋白質的表達水平隨所獲得的細胞克隆而變化。此外，一些細胞克隆存在著例如他們不表達靶蛋白的問題。為了克服這一缺點，采用了這樣一種方法，其中根據重組蛋白的表達水平來選擇大量的克隆，并且選擇最有利的克隆。然而這一篩選方法非常麻煩，需要投入大量的工作。用于避免這種棘手的工作且可快速選擇有利的克隆的各種方法已有報道。

例如，在一項公開的技術（PTL?2：JP?9(1997)-510865A）中，將載體整合到小鼠細胞的特異性染色體位置中。在重組細胞克隆池內通過載有與免疫球蛋白γ2A位同源的堿基序列的序列的載體來產生同源重組細胞克隆。目標染色體位置先標識為一個當外源基因整合后可提供比隨機整合更高的表達水平的位置。因此，當具有較高表達水平的同源重組細胞克隆在重組細胞克隆池中作為篩選目標而以給定的頻率出現時，根據表達水平來進行篩選的工作就會減少。

還公開了一種利用標記質粒的技術（PTL?3：JP?2001-516221A）。具有存在于標記質粒內的高表達水平的標記基因的克隆從通過標記質粒的隨機重組得到的細胞克隆種群中預先獲得。接下來，繼承了標記基因表達水平的靶蛋白生產克隆通過選擇細胞克隆來獲得，在所述細胞克隆中，在載有靶蛋白基因的質粒載體和隨機整合的標記質粒序列之間已經進行了位點特異性重組。

上述技術對于減少選擇具有高表達水平的克隆所需的工作是有利的。然而，例如當在不添加選擇性藥物的條件下對重組細胞進行連續培養時，由此獲得的克隆是否可以長時間穩定地保持表達水平就無法預知了。

在藥用蛋白的大規模生產中，蛋白的表達穩定地保持高水平是很重要的。尤其是從成本的角度以及從藥用蛋白的認證和安全的角度考慮，穩定地維持表達水平是很重要的。為了將重組蛋白生產細胞用于大規模生產，有必要擴大生產細胞克隆的培養規模。據估計，在一般情況下，在開始培養后需要從克隆中立即進行至少約60次細胞分裂（NPL?2：Brown,M.E.et?al.(1992)Cytotechnology,9,231-236），并且表達水平會維持在恒定的水平。

此外，選擇性藥物會造成更高的培養成本，同時還包括與為避免雜質混入藥劑的可能性而進行的分離純化過程有關的成本增長。因此，急需開發一種無需添加選擇性藥物就可以穩定地維持表達水平的細胞克隆制備技術。