[發明專利]DNA構建體以及用其制備重組CHO細胞的方法

無效

• 申請號: 201080054560.5
• 申請日: 2010-09-21
• 公開（公告）號: CN102639699A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 曾根崎修司;大神有美;山名良正;成田純也
• 申請（專利權）人: TOTO株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C07K16/00;C12N5/10
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉華聯

1.一種DNA構建體，從5'端到3'端包括第一同源DNA片段、靶蛋白基因以及第二同源DNA片段，

其中，第一和第二同源DNA片段具有能夠與CHO細胞基因組中的一部分次黃嘌呤-磷酸核糖基轉移酶(hprt)位點進行同源重組的同源性，并且具有不小于1kbp的鏈長度。

2.根據權利要求1所述的DNA構建體，其特征在于：第一和第二同源DNA片段的鏈長度為1-7.5kbp。

3.根據權利要求1所述的DNA構建體，其特征在于：第一和第二同源DNA片段的鏈長度為1-5kbp。

4.根據權利要求1所述的DNA構建體，其特征在于：所述一部分hprt位點是包含hprt基因的至少一部分內含子的區域。

5.根據權利要求1所述的DNA構建體，其特征在于：第一或第二同源DNA片段包括在SEQ?ID?No.15-22中的任何一個中描述的堿基序列或其部分序列。

6.根據權利要求1所述的DNA構建體，其特征在于：所述靶蛋白質是抗體、酶、細胞因子、激素、凝血因子、調節蛋白或受體。

7.根據權利要求1所述的DNA構建體，其特征在于：還包括正選擇標記基因。

8.一種載體，包括根據權利要求1所述的DNA構建體。

9.根據權利要求8所述的載體，其特征在于：源自人類hprt基因的第一內含子的核/基質粘附區域(MAR)被保持為這樣的結構，其中在載體整合到染色體中之后，MAR自身通過在整合位點處的轉錄來進行轉錄。

10.根據權利要求8或9所述的載體，其特征在于：包括操作性連接到靶蛋白基因上的CHEF-1α基因啟動子。

11.根據權利要求8到10中任一項所述的載體，其特征在于：所述載體是質粒載體、粘粒載體、噬菌體載體或人工染色體載體。

12.一種用于制備重組CHO細胞的方法，該方法包括將根據權利要求8到10中任一項所述的載體導入到CHO細胞中。

13.一種重組CHO細胞，包括整合到hprt位點中的外源靶蛋白基因。

14.根據權利要求13所述的重組CHO細胞，其特征在于：所述hprt基因的功能已被滅活。

15.一種通過根據權利要求12所述的方法制備的重組CHO細胞。

16.一種用于生產靶蛋白的方法，該方法包括：提供根據權利要求13或15所述的重組CHO細胞；以及培養該細胞以生產靶蛋白。