[發明專利]胰島素樣肽

有效

• 申請號: 201080053472.3
• 申請日: 2010-10-08
• 公開（公告）號: CN102844328A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: K·巴洛斯;K·巴洛斯
• 申請（專利權）人: 帕特雷化學和生物制藥學實驗室股份有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K14/62;C07K14/64;C07K14/65
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

胰島素樣肽(INSL)，例如結構類似于胰島素的這些肽，由2條肽鏈：A鏈和B鏈組成，此2條鏈通過2個分子間二硫鍵連接在一起，同時A鏈含有一個額外的分子內二硫鍵。一個例外是胰島素樣生長因子IGF-1和IGF-2，它們各由含70個氨基酸的一條肽鏈組成。

INSL家族除胰島素外還包括INSL3、INSL4、INSL5、INSL6、松弛素1（RLN1）、松弛素2（RLN2）和松弛素3（RLN3）以及生長因子IGF-1和IGF-2。

INSL肽顯示具有重要的生物學性能，它們決定了代謝，例如胰島素和IGF-1，并能調節生物體的重要狀態，例如妊娠受RLN1、RNL-2和INSL4調節。

胰島素銷售用于治療糖尿病并可視為最佳的被研究蛋白質，IGF-1用于重度原發性IGF-1缺陷病例治療并在多項臨床試驗中針對適應征例如I型糖尿病、II型糖尿病、阿爾茨海默癥、嚴重燒傷和肌強直性肌營養不良癥(MMD)等，RLN2在臨床試驗中測試了對急性心力衰減、先兆子癇和硬皮病的效果，除此以外關于其他INSL及它們的衍生物和拮抗物的生物學性能和可能的治療應用知之甚少。

一種情況中表明由一種INSL的A鏈和另一種INSL的B鏈組成的嵌合肽能與相應INSL的獨特受體相互作用并顯示顯著的生物學活性。此外，已表明由IGF-1的A部分和IGF-2的B部分組成肽鏈的IGF具有額外的重要生物學活性。對于大量的其它嵌合肽證明同樣如此。

尚未深入研究嵌合性INSL的生物學性能和可能的藥學應用，因為它們的制備非常困難。事實上只制備和研究了由INSL5的B鏈和其它INSL的各種A鏈組成的嵌合肽。特別是，已發現由RLN3的A鏈和INSL5的B鏈組成的RLN3A/TNSL5與GPCR135和GPCR142受體相互作用。

對于由INSL的二條不同鏈組成的嵌合肽僅有限研究的原因是其合成的難度和低產率。

迄今已采用的方法是A)隨機混合直鏈A鏈與B鏈及其氧化，B)混合在半胱氨酸殘基的巰基處含磺酸基團的A鏈，和C)定點構建A鏈與B鏈之間的三個二硫鍵。認為此方法是迄今為止制備INSL的最為改進的化學方法，雖然它需要多個步驟和5步層析純化。顯然所有上述方法非但不盡人意而且導致制備少量INSL的難度大及成本高。此外，這些方法不適合大規模生產。

由于化學合成困難，故采用重組DNA技術生產這些肽，例如胰島素、松弛素和IGF。但是重組DNA技術比常規的肽和蛋白質合成方法更為復雜。因此，即使在最簡單的IGF-1的情況中，還需要在分離得到其直鏈后選擇性形成3個二硫鍵。

產生由2條肽鏈組成的INSL變得甚至更為困難，因為該情況中用重組DNA技術合它們的前肽，如前胰島素、前松弛素等前肽后，需要選擇性形成二硫鍵并最后用酶去除各前肽中間的C-肽段。

制備RLN2甚至更為復雜，在切除C肽段后需要額外的步驟通過加熱將位于A鏈氨基末端的谷氨酰胺殘基轉變為焦谷氨酸殘基。因此，即使生物技術制備的INSL也很難制成，且需要多步層析純化才能獲得藥學上可接受純度的INSL。這些巨大的困難和高生產成本導致極大地延誤了對許多INSL生物學性能的評價和在臨床試驗中對它們的藥學應用測試，雖然認為它們的生物學活性是肯定的。這對于含胰島素鏈與其他INSL鏈結合的嵌合性INSL同樣成立。

發明內容

近年來我們發現并報道了一種隨機重組RLN1和RLN2鏈的簡單制備方法。該方法顯示很容易合成嵌合肽，例如由RNL2A/RLN1B所組成。用單環A鏈和雙環A鏈時該合成方法特別有效。這表明A鏈含有結構信息使其能與不對應鏈的天然對的胰島素B肽鏈結合。

在本發明中，我們描述了胰島素樣肽A鏈的結構特征使它識別并選擇性結合胰島素的所有B鏈和其它與那些肽相類似的鏈。肽鏈的結合總是選擇性給出對應預期和天然胰島素樣的結合。

例如，本發明表明雙環RLN2A識別并通過隨機組合不僅連接其它INSL的B鏈，還與理論上對應于INSL的B鏈和對應于作為單鏈肽而天然所見的IGF-1和IGF-2的B鏈隨機結合。這同樣可用于其它胰島素樣肽的結合，使我們有可能容易地制備具有可能的藥學活性的嵌合多肽。

在本發明中，描述了單環A鏈和雙環A鏈反應的主要副產物是B鏈氧化成環形B鏈。具體說，INSL的直鏈B鏈與雙環A鏈的反應非常快，如果A鏈過量在數分鐘內即可將該B鏈氧化成環形B鏈同步形成胰島素樣肽。

雙環A鏈肽有效氧化和產生二硫鍵連接的這種性能是一種氧化酶性能，因此我們可將胰島素樣肽的雙環A鏈稱為已知的最小的同時為強效的氧化酶，其還顯示能容易地組合其它肽鏈的能力。