[發明專利]純化聚乙二醇化蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201080053284.0
• 申請日: 2010-11-24
• 公開（公告）號: CN102639553A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: M.K.D.韋恩達爾;L.塞耶斯加爾德;A.博格斯內斯
• 申請（專利權）人: 諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;A61K38/48;A61P7/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 孔青;龐立志

發明領域

本發明涉及通過從含有聚乙二醇化(PEGylated)蛋白質的樣品中去除雜質來純化聚乙二醇化蛋白質(特別是，但不專指維生素K依賴性凝血因子例如因子IX?(FIX))的方法，涉及用所述方法純化的蛋白質，以及涉及所述純化后的蛋白質在治療中的用途，特別但并非唯一地涉及所述純化后的蛋白質在用于治療由凝血因子減輕的疾病中的用途，所述治療例如血友病的預防性治療。

發明背景

凝血是包括多種血液組分或因子的復雜相互作用的過程，這最終導致血纖蛋白血塊。通常，參與被稱為凝血“級聯”的血液組分為酶原(proenzyme或zymogen)，即通過激活劑的作用而被轉變為蛋白水解酶的無酶活的蛋白，所述激活劑本身為活化凝血因子。經過所述轉變后的凝血因子通常情況下稱作“活性因子”，并通過加上小寫“a”后綴來命名(例如因子VIIa)。

需要活化因子(Xa)來將凝血酶原轉變為凝血酶，其隨后將血纖蛋白原轉變為血纖蛋白，這作為形成血纖蛋白血塊的最后階段。有兩個系統或途徑促進因子X的活化。“內源途徑”是指通過利用僅存在血漿中的因子而致使凝血酶生成的那些反應。一系列由蛋白酶介導的活化最終生成因子IXa，其與因子VIIa一起將因子X裂解為因子Xa。相同的蛋白水解通過在凝血的“外源途徑”中的因子VIIa與其輔因子，組織因子來實現。組織因子為膜結合蛋白，并且通常不在血漿內循環。然而當血管破裂時，在Ca²⁺與磷脂存在下，其可與因子VIIa復合以催化因子X活化或因子IX活化。兩種凝血途徑在止血中的相對重要性尚不明確。

因子IXa?(FIXa)是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，其通過生成作為X酶復合物一部分的大多數因子Xa而在止血過程中發揮關鍵作用，凝血期間需要所述因子Xa來支持凝血酶的正確生成(Hoffman?M和Monroe?D.?M.,?III?(2001)?A?cell-based?model?of?hemostasis.?Thromb?Haemost?85,?958-965中的綜述)。因子IXa活性的先天性缺乏是X-連鎖的出血障礙血友病B的原因，所述血友病B影響約1:100,000的男性。這些血友病患者目前主要通過用重組或血漿-來源的凝血因子IX的替代療法來治療。

因子IX為維生素K依賴性凝血因子，其在結構上與因子VII、因子X和蛋白C相似。血漿半衰期為約18至30小時的循環的酶原形式由415個氨基酸組成，其可分為4個不同的結構域，所述結構域包括N末端的富含γ-羧基谷氨酸(Gla)結合域，兩個EGF結構域，和C末端胰蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶結構域。因子IX的活化通過以下而發生：在Arg¹⁴⁵-Ala¹⁴⁶和Arg¹⁸⁰-Val¹⁸¹的有限蛋白水解釋放35個氨基酸的片段，即所謂的激活肽(Schmidt?A.?E.和Bajaj?S.?P.?(2003)?Structure-function?relationships?in?Factor?IX?and?Factor?IXa.?Trends?Cardiovasc?Med?13,?39-45)。此激活肽高度糖基化，其包含個N連接和多達4個O連接聚糖。

蛋白質循環半衰期的延長可通過修飾蛋白質天然結構來實現。聚乙二醇化是已建立的一種用于延長蛋白質的循環半衰期的方法。因子IX?(FIX)的糖聚乙二醇化(GlycoPEGylation)生成多種聚乙二醇化物質，例如單、二和三-聚乙二醇化物質。如此的組合因而為形成多種單聚乙二醇化和二聚乙二醇化物質提供了可能性。單聚乙二醇化形式已被鑒定為具有期需的藥理學概況(profile)，并因而被選為優選的藥物候選物。因此，從聚乙二醇化和非聚乙二醇化物質的混合物中分離單聚乙二醇化形式是期需的。

除了聚乙二醇化物質彼此分離及其與非聚乙二醇化物質的分離之外，純化過程還必須提供充分減少的反應中所使用試劑。開發一種保證期需產物質量的方法是必要的，并且將有利的是，開發可提供充分減少的過程相關雜質(例如聚乙二醇化試劑、酶、來自試劑的副產物)以及產物相關雜質(例如非聚乙二醇化物質)的單個步驟純化。

US?2008/207879?(Baxter?Int)描述了rFIX的純化過程，其包括將產物加入陰離子交換柱，和用超過200?mM的鹽濃度洗柱子，以及用包含二價陽離子的洗脫緩沖液洗脫。

發明概述