[發(fā)明專利]用于純化由固相肽合成法制備的肽的化合物和方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080051790.6
• 申請日: 2010-11-16
• 公開（公告）號: CN102666565A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設計）人: V·奧卡涅;A·戴爾馬
• 申請（專利權）人: 國家科學研究中心
• 主分類號: C07K1/00
• 分類號: C07K1/00;C07K1/107;C07K7/04;C07K14/435
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平

技術領域

本發(fā)明涉及用于純化由固相肽合成法制備的肽的化合物和方法。

背景技術

肽的化學合成法被很好的建立。原則上，分為兩種不同的方法：溶液中合成，其經常是非常耗時的并因此對科學研究無用；和固相載體上合成，其允許快速優(yōu)化反應周期?？捎糜诠滔嚯暮铣?SPPS)的方案是基于用規(guī)定的序列在不溶性固相上合成肽的Merrifield技術(Merrifield，R.B.，J.Amer.Chem.Soc.85，1963，2149)。SPPS的總的原理是基于反復的偶聯(lián)-脫保護循環(huán)：通過羧基端連接在固相上的肽的游離N-端胺與單個N-保護的氨基酸單元偶聯(lián)。該單元然后脫保護，顯露出可以連接另一個氨基酸的新的N-端胺。

然而，現今的SPPS方法除了目標化合物(成熟肽)之外，還產生相對眾多的雜質，特別是大量的不成熟肽。因此源自固相肽合成(SPPS)的肽的純化需要除去由不完全的偶聯(lián)/脫保護步驟而產生的被刪過的肽(即缺乏一個或幾個氨基酸殘基的肽)，和程度少得多的來自外消旋化或側鏈重排的其他肽副產物，以及SPPS程序的脫保護或裂解階段期間引入的各種化學物質。尤其是，要合成的肽越長，雜質的數量、特別是被刪過的肽的數量越多。因此，SPPS法的重要目標是從雜質中高速高收率地只回收目標肽。

因此，已有建議在每次偶聯(lián)反應后通過乙酸酐進行封端，以終止非目標序列肽鏈的進一步伸長并避免進一步產生被刪過的肽和得到截短的肽。在連接最后的氨基酸后，只有具有完整氨基酸序列的肽在其N-端具有氨基：該氨基可用于純化目標肽。

已經公開了幾篇利用N-端氨基的肽純化法的報告。然而，這些方法均不能實現有效的一步分離；反而需要復雜的分離過程。

已經開發(fā)了另一種方法，其中只有目標肽在它的N-端被兩個額外的殘基(半胱氨酸-甲硫氨酸)延長，然后與被苯基-汞基團衍生化的固相載體起反應，所述苯基-汞基團利用了選擇性結合半胱氨酸的SH基團。在分離之后，甲硫氨酸-肽的酰胺鍵被BrCN選擇性裂解，以產生目標肽(D.E.Kriegeret?al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，73，3160(1976))。可是，該方法的局限是不適用于含甲硫氨酸或半胱氨酸的肽。

另一種已經公開的方法中，目標肽與固相載體通過SH基團共價連接(美國專利n°5,648,462和n°5,994,588)。可是，該方法的局限是不適用于含半胱氨酸的肽。

因此，需要有其他的方法來純化通過SPPS產生的肽，所述方法適用于任何類型的肽并且是易于實施的。

發(fā)明內容

本發(fā)明人發(fā)現，在SPPS結束時，并且在肽從固相上脫保護/裂解步驟之前，有可能用包含以連接體分開的兩個化學官能團的化合物來選擇性標記成熟肽。通過根據本發(fā)明所述化合物與特定固相反應，該化合物能因此用于將成熟肽從其他封端的截短肽(不成熟肽)中純化出來。本發(fā)明因此涉及通式(I)的化合物：

X₁-L-X₂(I)

其中：

-X₁選自-N₃或-C≡CH，

-L表示隔開X₁和X₂的連接體，

-X₂選自通式(A)、(B)和(C)的化合物：

其中

■Y₁和Y₂獨立地表示-CH-或-N-，

■Y₃表示-OH或離去基團，

■R₁和R₂獨立地表示-H、-CH₃或C₂-C₅烷基，

■虛線存在或不存在，

■當虛線存在時，R₃是O且R₄不存在，

■當虛線不存在時，R₃和R₄表示-CH₃；

其中

■R₅表示-H或吸電子基團，

■R₆和R₇獨立地表示-CH₃或-H，

■X₃是氨基甲酸酯前體；

和

其中：