[發明專利]用于檢測幽門螺桿菌和/或克拉霉素抗性特征的肽核酸探針，試劑盒和方法及應用

無效

• 申請號: 201080048320.4
• 申請日: 2010-09-13
• 公開（公告）號: CN102597267A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: N·F·里貝羅品托德奧利維拉阿澤維多;L·I·馬茨埃拉瑟魁拉;N·R·托雷斯法里亞;M·J·洛普斯達哥斯達維埃拉
• 申請（專利權）人: 米尼奧大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

【技術領域】

本發明涉及臨床關聯微生物的檢測方法和抗生素抗性特征領域。開發4種肽核酸探針(PNA)以檢測存在對克拉霉素的應答(抗性/感受性)的幽門螺桿菌(H.pylori)和/或株。

本發明的另一方面涉及將這些探針及所述檢測方法應用到用于在生物學樣品中幽門螺桿菌(H.pylori)的克拉霉素抗性的檢測的試劑盒，由此具有臨床應用。

【背景技術】

幽門螺桿菌(H.pylori)是定居人胃粘膜的病原性細菌，相關于胃感染諸如慢性胃炎，消化性潰瘍，萎縮性胃炎和胃癌。

幽門螺桿菌(H.pylori)感染可基于侵襲性方法，諸如胃活組織檢查(內窺鏡檢查)，或非-侵襲性方法諸如脲呼吸測試，血清學測試或糞便抗原測試來診斷。后者更頻繁地用于臨床實踐，因為它們對于患者不太昂貴和更方便。

最通常使用的測試/試劑盒可檢測特定幽門螺桿菌(H.pylori)酶，脲酶(US200306856和EP0920531)。但是，由于在標準方法中存在的敏感度/特異性的缺乏，在更細節化的診斷中仍優選使用侵襲性方法。

實際上，用內窺鏡活組織檢查，可能使用基于培養的測試，諸如E-測試和瓊脂稀釋方法或通過基于PCR(聚合酶鏈反應)的分子方法獲得更可靠的關乎幽門螺桿菌(H.pylori)存在的信息。但是，第1是苛刻和耗時，第2是需求一些額外護理以避免可能的可導致假陽性或假陰性的DNA污染。

近來，開發出肽核酸探針(PNA)并優化用于細菌檢測。PNA分子是其帶負電的糖-磷酸主鏈結構被由重復的(2-氨基乙基)甘氨酸單元形成的非手性及電中性取代的DNA模擬物。

盡管，PNA分子缺乏戊糖，PNA和互補DNA序列之間的特異性雜交可通過氫鍵合發生，遵從Watson-Crick規則。

相比傳統上使用的典型DNA探針，PNA的電中性性質有助于PNA和靶序列(rRNA和雙鏈DNA)之間的更穩健的雜交。由于其高親和性，PNA探針具有相對較短的核苷酸序列(8～17個核苷酸)。DNA探針通常具有至少18個核苷酸，由于其弱穩定性及更低熔解溫度(Tm)，需要用酶和其他劑的額外的固定和滲透化過程。相比DNA分子，PNA分子提供對于蛋白酶和核酸酶的更高抗性。

PNA探針可通過顯微鏡檢或流式細胞術，當附接于熒光色素時通過熒光原位雜交技術(FISH)檢測。

與傳統培養方法比較，此技術在臨床樣品中產生更迅速結果，也有改善的功效，敏感度和特異性。其提供廣范圍的應用和可應用于不同微生物學領域，諸如在人，環境和食品樣品中的微生物檢測。

已設計并公開/授專利權用于臨床微生物，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)，炭疽芽孢桿菌(Bacillus?anthracis)，非金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?non-aureus)物種，人乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)，及念珠菌屬(Candida)的檢測的探針的一些例顯示此技術的增加的興趣。

已可利用用于幽門螺桿菌(H.pylori)的特異性檢測的PNA探針(Azevedo?N.F.等人，2003)。而且，要求了另一探針的專利(WO2008155742-A2；PT103767-A1)。后者顯示相當地高特異性和敏感度，蓋過使用的標準方法N.等人，2007)。盡管幽門螺桿菌(H.pylori)檢測重要，期望鑒定幽門螺桿菌(H.pylori)抗生素抗性，其不可能使用僅上述探針檢測。

實際上，最通常使用的用于幽門螺桿菌(H.pylori)根除的治療是三重治療，其包含質子泵抑制物和2種抗生素(例如克拉霉素，甲硝唑，阿莫西林)持續7～14天。此治療可對患者導致不適，由于抗生素過度利用及它們可導致的次級效應。

此外，此治療的成功被幽門螺桿菌(H.pylori)對克拉霉素(在這些情況中使用的優秀的抗生素)的抗性的增加所阻礙。目前，克拉霉素抗性通過培養方法或PCR檢測，但這些方法與用于幽門螺桿菌(H.pylori)檢測的那些及以上描述的具有相同的限制。因此，由于迅速，可靠的和實踐方法的缺乏，在治療開始之后或在已證明其無效之后通常獲得幽門螺桿菌(H.pylori)的各株的克拉霉素抗性。本發明描述抗性株鑒定的可靠的，實踐的和穩健的應用，及提供對患者的充分的治療選擇，免公害，風險，治療時間，及成本的顯著貢獻。