[發(fā)明專利]RNA指數(shù)式擴(kuò)增的方法以及RNA反應(yīng)器

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080046916.0
• 申請(qǐng)日: 2010-10-21
• 公開（公告）號(hào): CN102597264A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雅克·羅哈耶姆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 里博克斯艾克斯有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種采用引物非依賴性RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRp)進(jìn)行RNA指數(shù)式擴(kuò)增的方法，其中反應(yīng)物進(jìn)行預(yù)混，然后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)室中，進(jìn)行互補(bǔ)鏈的聚合反應(yīng)以及產(chǎn)物雙鏈RNA的分離。本發(fā)明還涉及一種用于實(shí)現(xiàn)RNA指數(shù)式擴(kuò)增的RNA反應(yīng)器。

背景技術(shù)

與采用PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法相比，現(xiàn)有的RNA擴(kuò)增方法存在多種缺陷：使用T7聚合酶進(jìn)行mRNA擴(kuò)增的方法(SMART^TM?mRNA擴(kuò)增試劑盒使用指南，Clontech?Laboratories，Inc.，2008年4月28日；US?5,962,271，US?5,962,272)包含以下復(fù)雜又耗時(shí)的酶催化步驟：

1)以待擴(kuò)增的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行雙鏈cDNA的合成。該反應(yīng)通常需要加入引物依賴性RNA依賴性的DNA聚合酶，例如來源于禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)或鼠科白血病病毒(Molooney?Murine?Leukemia?Virus(MuLV)。

2)以合成的雙鏈DNA為模板采用T7聚合酶催化合成RNA。該T7聚合酶是一種引物依賴性DNA依賴性的RNA聚合酶，并且要求在引物序列中具有T7特定啟動(dòng)子序列用于引發(fā)聚合反應(yīng)。

采用T7聚合酶催化的RNA擴(kuò)增呈線性增長(zhǎng)。

另一種被提出應(yīng)用于RNA擴(kuò)增的酶為Qβ復(fù)制酶(參見WO?02/092774A2)。該Qβ復(fù)制酶是一種RNA依賴性的RNA聚合酶，同樣要求具有特定序列識(shí)別位點(diǎn)的引物用于引發(fā)聚合反應(yīng)。這種采用Qβ復(fù)制酶催化的RNA擴(kuò)增同樣呈線性增長(zhǎng)。

此外，使用來自于噬菌體Phi-6到Phi-14的聚合酶進(jìn)行RNA的擴(kuò)增要求特定啟動(dòng)子序列的出現(xiàn)。Phi-6到Phi-14的酶是一種RNA依賴性的RNA聚合酶。但是采用這種酶催化的RNA擴(kuò)增同樣只是呈線性增長(zhǎng)。

專利WO?2007/12329A2公開了一種使用杯狀病毒科家族的RdRp(RNA依賴性的RNA聚合酶)進(jìn)行制備和標(biāo)記RNA的方法。該作者示出了以單鏈RNA(ssRNA)為模板，在具有或缺乏RNA合成引發(fā)寡核苷酸(長(zhǎng)度少于10nt的寡核苷酸引物)的情況下，均成功地實(shí)現(xiàn)了RNA合成的重復(fù)循環(huán)以及雙鏈RNA(dsRNA)產(chǎn)物的變性。在專利WO?2007/12329A2中也并沒有出現(xiàn)RNA的指數(shù)式擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種實(shí)現(xiàn)RNA指數(shù)式擴(kuò)增的高效方法。

上述技術(shù)問題的解決方案通過權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的實(shí)施例來提供。

特別是，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種實(shí)現(xiàn)RNA指數(shù)式擴(kuò)增的方法，包括以下步驟：

(a)在一個(gè)混合室中將單鏈RNA(ssRNA)，引物非依賴性RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRp)，NTPs(例如，核苷酸rATP，rCTP，rGTP和rUTP(rNTPs)和/或修飾，和/或標(biāo)記的rNTPs，和/或脫氧核苷酸(dNTPs)，和/或修飾的，和/或標(biāo)記的dNTPs)，反應(yīng)緩沖液，以及，可選地，RNA合成引發(fā)寡核苷酸進(jìn)行混合；

(b)將步驟(a)中的混合物轉(zhuǎn)移至反應(yīng)室中；

(c)可選地，將所述RNA合成引發(fā)寡核苷酸退火到所述ssRNA上；

(d)在所述反應(yīng)室中將所述混合物在一定條件下溫育，使得引物非依賴性RdRp從頭合成出一條與所述ssRNA互補(bǔ)的RNA鏈，或者，可選地，所述RdRp通過延伸雜交到所述ssRNA上的所述RNA合成引發(fā)寡核苷酸(寡核苷酸引物)從而形成雙鏈RNA(dsRNA)；

(e)將在步驟(d)中合成的所述dsRNA鏈分離成ssRNA；

(f)在所述混合室中將引物非依賴性RdRp，NTPs，反應(yīng)緩沖液，以及，可選地，寡核苷酸引物進(jìn)行混合；

(g)將所述步驟(f)中的混合物轉(zhuǎn)移至所述反應(yīng)室中；

(h)重復(fù)步驟(d)-(g)，或者，可選地，(c)-(g)，至少5次，優(yōu)選為5-100次；

(i)實(shí)行最終的溫育步驟(d)從而形成終產(chǎn)物dsRNA；以及，可選地，

(j)從所述反應(yīng)室中回收所述終產(chǎn)物dsRNA。