[發明專利]RNA指數式擴增的方法以及RNA反應器

無效

• 申請號: 201080046916.0
• 申請日: 2010-10-21
• 公開（公告）號: CN102597264A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 雅克·羅哈耶姆
• 申請（專利權）人: 里博克斯艾克斯有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪

1.一種RNA指數式擴增的方法，包括以下步驟：

(a)在混合室中將單鏈RNA，引物非依賴性RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRp)，NTPs，反應緩沖液，以及，可選地，RNA合成引發寡核苷酸混合；

(b)將步驟(a)中的混合物轉移至反應室；

(c)可選地，將所述RNA合成引發寡核苷酸退火到所述單鏈RNA上；

(d)在所述反應室中將所述混合物在條件下溫育，使得引物非依賴性RdRp從頭合成出與所述單鏈RNA互補的RNA鏈，可選地，所述RdRp延伸雜交到所述單鏈RNA上的RNA合成引發寡核苷酸從而形成雙鏈RNA；

(e)將步驟(d)中形成的所述雙鏈RNA分離成單鏈RNA；

(f)在混合室中將引物非依賴性RdRp，NTPs，反應緩沖液，以及，可選地，RNA合成引發寡核苷酸混合；

(g)將步驟(e)中的混合物轉移至所述反應室中；

(h)重復步驟(d)-(g)，或者，可選地，(c)-(g)至少5次；

(i)進行最終的溫育步驟(d)從而合成終產物雙鏈RNA，以及，可選地，

(j)從所述反應室回收所述終產物雙鏈RNA。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(h)中重復步驟(d)-(g)，或者，可選地，(c)-(g)5-100次。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引物非依賴性RdRp具有“右手構象”，所述RdRp的氨基酸序列包含以下基序的保守區域：

a.XXDYS

b.GXPSG

c.YGDD

d.XXYGL

e.XXXXFLXRXX

具有以下含義：

D：天冬氨酸

Y：酪氨酸

S：絲氨酸

G：甘氨酸

P：脯氨酸

L：亮氨酸

F：苯丙氨酸

R：精氨酸

X：任何氨基酸

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物非依賴性RdRp是一種杯狀病毒科家族的RdRp。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物非依賴性RdRp是一種諾沃克病毒，沙波病毒，豬水泡皰疹病毒，或兔出血癥病毒的RdRp。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物非依賴性RdRp是一種選自于諾沃克病毒菌株HuCV/NL/Dresden174/1997/GE(GenBank登錄號為AY741811)的RdRp，或者沙波病毒菌株pJG-Sap01(GenBank登錄號為AY694184)的RdRp，或者豬水泡皰疹病毒菌株FCV/Dresden/2006/GE(GenBank登錄號為DQ424892)的RdRp。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物非依賴性RdRp具有選自于SEQ?ID?NO：1，SEQ?ID?NO：2，SEQ?ID?NO：3，SEQ?ID?NO：4，SEQ?ID?NO?5，SEQ?ID?NO：6和SEQ?ID?NO：7的氨基酸序列。

8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，ssRNA模板具有15-30，優選為21-28，更優選為21-23個核苷酸的長度。

9.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述ssRNA模板具有超過30個核苷酸的長度。

10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述ssRNA模板是mRNA。

11.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(d)和(f)中的反應體積在每個循環步驟(h)中加倍。

12.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(f)和(g)在第2至第10個循環的步驟(h)中進行。

13.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)和(f)中的反應體積在每個循環步驟(h)中加倍，所述循環步驟(h)中進行所述步驟(f)和(g)。

14.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和/或(f)在2-8℃下進行，優選為4℃。