[發明專利]用于改進重組蛋白表達的方法

在審

• 申請號: 201080044475.0
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN102648285A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 豪爾·羅伯特·葛萊罕·克拉克
• 申請（專利權）人: CMC依科斯生技制品公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07H21/04
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶;於毓楨

相關申請的交叉引用?

本申請案要求2009年8月6日提交的題為“Methods?for?Improving?Recombinant?Protein?Expression”的美國臨時申請案第61/231,906號的優先權利益，此申請案的代理人案號為31351/44743，其全文以引用的方式并入本文。?

技術領域

本發明借助于增加載體上的選擇壓力，從而增加載體相關的異源蛋白表達，在真核細胞中的重組蛋白表達領域中具有實際應用。?

背景技術

在重組蛋白產生領域中，增加轉染基因的表達是細胞系發育期間的基本首要工作。改進轉錄、翻譯、蛋白質折疊和分泌是增加異源蛋白效價的密集研究的所有目標。?

無論過去所用方法如何，本領域中需要提供增加所需蛋白的產率的較好的用于重組蛋白產生的方法。?

發明內容

一方面，本發明提供一種用于增加宿主細胞中的異源蛋白表達的方法，所述方法包括以下步驟：在允許蛋白表達的條件下培養包含編碼所述異源蛋白的第一異源多核苷酸序列的宿主細胞，所述第一多核苷酸在載體上編碼，所述宿主細胞進一步包含具有針對選擇標記蛋白的蛋白編碼序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸與編碼所述選擇標記蛋白的野生型多核苷酸相比具有序列修飾，所述序列修飾降低由所述第二多核苷酸編碼的mRNA的翻譯效率，具有所述序列修飾的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸編碼針對所述選擇標記蛋白的相同氨基酸序列。一方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在單個載體中，且在這方面的一個實施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不同啟動子的轉錄控制。在其它方面，所述第一多核苷酸和所?述第二多核苷酸在獨立載體中。另一方面，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸受相同啟動子的轉錄控制。?

在所述方法的一個實施方案中，所述修飾在編碼所述選擇標記蛋白的第二多核苷酸的非翻譯區中，且在某些方面，所述修飾在5′非翻譯區中和/或所述修飾在3′非翻譯區中。?

在所述方法的另一實施方案中，所述修飾在編碼所述選擇標記蛋白的基因的蛋白編碼區中。一方面，所述修飾在針對選擇標記基因編碼序列的蛋白編碼區的起始密碼子的25、20、15、10或5個密碼子中。?

在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，所述被修飾的密碼子作為密碼子，并非是針對所述宿主細胞編碼的所述氨基酸的偏好密碼子。一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，所述被修飾的密碼子作為密碼子，是針對所述宿主細胞編碼的所述氨基酸的最不偏好密碼子。?

在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾在所述mRNA的二級結構中引入了降低所述mRNA的翻譯效率的變化。在所述方法的一個實施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾增加mRNA中的密碼子配對。在所述方法的另一實施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾改變mRNA的G+C含量。在多個方面，所述修飾增加mRNA的G+C含量，且在多個方面，G+C含量增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、?71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在其它方面，G+C含量增加超過100%。?