[發明專利]具有經修飾的前原區域的蛋白酶

有效

• 申請號: 201080043790.1
• 申請日: 2010-04-15
• 公開（公告）號: CN102575242A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: A·比薩奇科;B·F·施密特
• 申請（專利權）人: 丹尼斯科美國公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/57;C07H21/04
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 黃革生;林柏楠

技術領域

本發明涉及編碼經修飾的蛋白酶的經修飾的多核苷酸，本發明還涉及用于改變蛋白酶在微生物中的生產的方法。特別地，經修飾的多核苷酸包含一個或多個突變，編碼具有改變的前原(pre-pro)區域的經修飾的蛋白酶，所述修飾的前原區域增強該活性酶的生產。本發明還涉及用于改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)物種)中的生產的方法。

背景技術

細菌來源的蛋白酶是重要的工業酶，其占所有酶銷售量的大多數，在多種工業(包括洗滌劑、肉嫩化、干酪制造、脫毛、烘焙、釀造、助消化劑的生產、以及從攝影膠片回收銀)中被廣泛應用。這些酶作為洗滌劑添加劑的應用促進了它們的商業發展，并導致對這些酶的基礎研究的大幅擴增(Germano等，Enzyme?Microb.Technol.32：246-251[2003])。除了作為洗滌劑和食品添加劑，蛋白酶(例如，堿性蛋白酶)在其它工業領域(例如皮革、紡織、有機合成、以及廢水處理)中也具有廣泛的應用((Kalisz，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，36：1-65[1988])和(Kumar和Takagi，Biotechnol.Adv.，17：561-594[1999]))。

隨著對這些工業酶的高要求，具有新穎特性的堿性蛋白酶持續成為研究興趣的重點，從而導致了具有改良的催化效率和對溫度、氧化劑及變化的使用條件具有更佳穩定性的新蛋白酶制劑。然而，酶生產和下游加工的總成本仍然是酶工業中任何技術成功應用所面臨的主要障礙。為了解決這個問題，研究人員和工藝工程師采用了幾種方法，相對于堿性蛋白酶的工業需求，增加堿性蛋白酶的產量。

盡管采用了多種方法(包括篩選高產菌種、克隆和過表達蛋白酶、改進補料分批發酵和恒化器發酵、以及優化發酵技術)來增加蛋白酶的產量，但仍然需要額外的手段來提高蛋白酶的生產。

發明概述

本發明提供經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶；本發明還提供用于改變蛋白酶在微生物中的生產的方法。特別地，經修飾的多核苷酸包含一個或多個突變，編碼前原(pre-pro)區域具有修飾的經修飾的蛋白酶，所述前原區域的修飾增強該活性酶的生產。本發明還涉及用于改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌屬物種)中的生產的方法。

在一個實施方案中，本發明提供了編碼經修飾的全長蛋白酶的分離的修飾多核苷酸，其中該分離的經修飾的多核苷酸包含編碼該全長蛋白酶的前原區域的第一多核苷酸，該第一多核苷酸有效地連接到編碼該全長蛋白酶的成熟區域的第二多核苷酸上，其中第一多核苷酸編碼SEQ?ID?NO：7的前原區域，并進一步被突變而包含至少一個增強該蛋白酶在宿主細胞中的生產的突變。優選地，宿主細胞為芽孢桿菌屬物種宿主細胞，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)宿主細胞。在一些實施方案中，經修飾的全長蛋白酶為絲氨酸蛋白酶，其源自野生型的或變體的親本絲氨酸蛋白酶，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilis)或地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)的絲氨酸蛋白酶。

在另一個實施方案中，本發明提供了分離的、經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的全長蛋白酶，其中該分離的、經修飾的多核苷酸包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸編碼該全長蛋白酶的前原區域，并有效地連接到第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編碼全長蛋白酶的成熟區域，其中第一多核苷酸編碼SEQ?ID?NO：7的前原區域，并進一步被突變以包含至少一個增強宿主細胞的蛋白酶生產的突變，第二多核苷酸編碼與SEQ?ID?NO：9的成熟蛋白酶至少約65％相同的蛋白酶。優選地，第二多核苷酸編碼SEQ?ID?NO：9的成熟蛋白酶。在一些實施方案中，經修飾的全長蛋白酶為絲氨酸蛋白酶，其源自野生型的或變體的親本絲氨酸蛋白酶，例如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶。優選地，宿主細胞為芽孢桿菌屬物種宿主細胞，例如枯草芽孢桿菌宿主細胞。