[發明專利]核酸擴增方法

無效

• 申請號: 201080041390.7
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN102549154A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 遠山將史
• 申請（專利權）人: 東洋制罐株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12Q1/68
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

技術領域

本發明涉及核酸擴增方法，特別是使用經化學修飾的引物和環狀單鏈DNA的組合的核酸擴增方法、利用上述方法檢測是否存在目標基因的方法以及在上述方法中使用的檢測用試劑盒。

背景技術

現在，在研究機構、醫療機構、檢查機構及其它各種現場，基于目標基因的特異性堿基序列的分析方法和檢測方法被廣泛使用。例如，在分析和檢測人和動物等生物體來源的試樣(體液或細胞片)或來源于環境的試樣中所含的病原菌、霉菌、螨等過敏原等病原性的微生物和微小動物、病毒和花粉等的存在時，也采用了檢測這些檢測對象所具有的目標基因的特異性堿基序列的方法。檢測這些核酸(DNA、RNA)的方法與檢測蛋白質的方法相比，能夠在短時間內以高靈敏度進行。而且，即使試樣中原本所含的核酸量在檢出限(detection?limit)以下，也可以使用無細胞系較為簡單且特異性地擴增。由于這些優點，利用擴增核酸的方法或與擴增核酸的方法組合來檢測目標基因中的特異性堿基序列的方法被廣泛開發。

目前，作為最常用的核酸擴增方法，可以列舉利用溫度循環進行數十次的模板的變性、引物與模板的退火、DNA聚合酶延伸反應的循環，從而擴增夾在引物對之間區域的核酸的PCR法。但是，在利用溫度循環擴增核酸的方法中，存在用于控制溫度循環的機器(熱循環儀等)價格高、需要對核酸擴增的最佳溫度循環進行研究和設定等問題，因此近年來開始考慮不利用溫度循環而在一定溫度條件下進行DNA聚合酶延伸反應的核酸擴增方法。其代表性的方法可列舉LAMP(環介導等溫擴增，Loop-Mediated?Isothermal?Amplification)法(專利文獻1)，除此之外，為了克服成本、檢測方法的設計和操作、檢測靈敏度等問題，還正在開發利用與環狀單鏈DNA的組合的核酸擴增方法(專利文獻2)。

但是，即使利用上述方法，在試樣中所含有的檢測對象核酸為微量的情況下，也存在檢測靈敏度未必充分的情況。因此，需要擴增效率和檢測靈敏度進一步提高的新的核酸擴增方法和檢測方法。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開第2000/28082號小冊子

專利文獻2：國際公開第2008/026719號小冊子

發明內容

發明要解決的問題

本發明的目的在于提供一種基于新原理的核酸擴增方法，該方法能夠簡便地且在短時間內高效擴增具有特定堿基序列的核酸；另外提供利用了該方法的核酸檢測方法。

用于解決問題的方案

本發明人發現，對具有特異性堿基序列的模板核酸分子，通過使用具有與上述堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物以及含有上述特異性堿基序列的環狀單鏈DNA的組合，連鎖地進行DNA聚合酶延伸反應，能夠解決上述課題，由此完成了本申請發明。

即，本發明提供一種核酸擴增方法，其特征在于，包括：

(a)使用含有擴增對象堿基序列的模板DNA、和包含具有與上述堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物的引物對來進行DNA聚合酶延伸反應，得到直鏈狀DNA片段；和

(b)以含有擴增對象堿基序列的環狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀DNA片段的3’端作為復制起點，進行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應。

另外，本發明提供一種核酸擴增用試劑盒，其含有：

(i)包含具有與擴增對象堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物的引物對；

(ii)含有擴增對象堿基序列的環狀單鏈DNA；

(iii)鏈取代型DNA聚合酶；

(iv)dNTP。

另外，本發明提供一種檢測雙鏈的目標核酸分子的方法，其包括：

(a)在檢測對象試樣中添加包含具有與目標核酸分子的目標堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物的引物對、含有目標堿基序列的環狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進行酶反應；

(b)確認在進行了酶反應的試樣中核酸是否被擴增；和

(c)在核酸被擴增時，確定檢測對象試樣中存在雙鏈的目標核酸分子。

另外，本發明提供一種檢測單鏈的目標核酸分子的方法，其包括：