[發明專利]核酸擴增方法

無效

• 申請號: 201080041390.7
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN102549154A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 遠山將史
• 申請（專利權）人: 東洋制罐株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12Q1/68
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

1.一種核酸擴增方法，其特征在于，包括：

(a)使用含有擴增對象堿基序列的模板DNA、和包含具有與上述堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物的引物對來進行DNA聚合酶延伸反應，得到直鏈狀DNA片段；和

(b)以含有擴增對象堿基序列的環狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀DNA片段的3’端作為復制起點，進行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，化學修飾為向RNA殘基、LNA殘基或ENA殘基的變更或者向肌苷殘基的變更。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，對構成引物對的2種引物均進行了化學修飾。

4.根據權利要求1～3中任一項所述的方法，其中，進一步添加第二引物對來進行工序(a)，該第二引物對由在構成工序(a)中使用的引物對的各引物的5’端側分別進行了設計的2種引物構成。

5.根據權利要求1～4中任一項所述的方法，其中，在同一溫度條件下進行(a)和(b)。

6.根據權利要求1～5中任一項所述的方法，其中，含有擴增對象堿基序列的模板DNA含有由以RNA為模板的逆轉錄所得到的DNA鏈。

7.一種核酸擴增用試劑盒，其含有：

(i)包含具有與擴增對象堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物的引物對；

(ii)含有擴增對象堿基序列的環狀單鏈DNA；

(iii)鏈取代型DNA聚合酶；

(iv)dNTP。

8.一種檢測雙鏈的目標核酸分子的方法，其包括：

(a)在檢測對象試樣中添加包含具有與目標核酸分子的目標堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物的引物對、含有目標堿基序列的環狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進行酶反應；

(b)確認在進行了酶反應的試樣中核酸是否被擴增；和

(c)在核酸被擴增時，確定檢測對象試樣中存在雙鏈的目標核酸分子。

9.一種檢測單鏈的目標核酸分子的方法，其包括：

(a)在檢測對象試樣中添加具有與目標核酸分子的目標堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物、具有與目標核酸分子的上述目標堿基序列的區域不同區域的目標堿基序列的3’端側相鄰的區域的堿基序列且3’端經化學修飾的引物、含有上述目標堿基序列的環狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進行酶反應；

(b)確認在進行了酶反應的試樣中核酸是否被擴增；和

(d)在核酸被擴增時，確定檢測對象試樣中存在單鏈的目標核酸分子。

10.一種雙鏈的目標核酸分子的檢測用試劑盒，其含有：

(i)包含具有與雙鏈的目標核酸分子的目標堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物的引物對；

(ii)含有目標堿基序列的環狀單鏈DNA；

(iii)鏈取代型DNA聚合酶；和

(iv)dNTP。

11.一種單鏈的目標核酸分子的檢測用試劑盒，其含有：

(i)具有與單鏈的目標核酸分子的目標堿基序列的3’端側相鄰的區域的互補堿基序列且3’端經化學修飾的引物；

(ii)具有與目標核酸分子的上述目標堿基序列的區域不同區域的3’端側相鄰的區域的堿基序列且3’端經化學修飾的引物；

(iii)含有目標堿基序列的環狀單鏈DNA；

(iv)鏈取代型DNA聚合酶；和

(v)dNTP。

12.根據權利要求10或11所述的檢測用試劑盒，其還含有(vi)逆轉錄酶。