[發明專利]對循環腫瘤細胞進行分類的方法

在審

• 申請號: 201080039127.4
• 申請日: 2010-09-02
• 公開（公告）號: CN102482703A
• 公開（公告）日: 2012-05-30
• 發明（設計）人: P·昆
• 申請（專利權）人: 斯克里普斯研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;A01N63/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

發明背景

發明領域

本發明總體涉及醫學診斷，更具體涉及循環腫瘤細胞的分類。

背景信息

循環腫瘤細胞(CTC)通常是——雖然不是總是——進入不同類型癌癥患者血流的濃度非常低的源自實體腫瘤的上皮細胞。已存在的腫瘤轉移或釋放CTC通常導致繼發性腫瘤形成。繼發性腫瘤一般檢測不到，并且占全部癌癥死亡的90％。循環腫瘤細胞提供原發性與轉移性腫瘤之間的聯系。這產生將循環腫瘤細胞的鑒定和表征用于轉移性上皮惡性腫瘤的早期檢測和治療控制的前景。癌癥患者的CTC檢測提供早期診斷原發性或繼發性癌癥生長和確定進行癌癥治療的癌癥患者的預后的有效工具，因為這些患者血液中存在的CTC的數量和特征與整體預后和對治療的反應相關聯。因此，CTC在臨床癥狀出現前充當腫瘤擴大或轉移的早期指示物。

雖然循環腫瘤細胞(CTC)的檢測在癌癥的控制和治療中具有重要的預后意義和潛在治療意義，但由于其在血液流中的隱匿性質，這些微量的細胞不容易被檢測到。CTC首次被描述是在19世紀，然而只是最近的技術進步允許其可靠檢測。CTC被認為以超低濃度存在于腫瘤患者的外周血液中。例如，對于癌(carcinomas)患者，據估計每一千萬正常血液細胞中有一個是CTC。

CTC計數/表征的標準方法是靶向表面蛋白EpCam的免疫磁性富集法、光纖陣列掃描技術和“CTC芯片”分析。

免疫磁性富集技術依賴于利用鐵磁流體進行的腫瘤細胞群免疫磁性富集，該鐵磁流體連接于結合上皮細胞粘著分子(EpCAM)的抗體，該上皮細胞粘著分子僅在上皮衍生細胞上表達。

在進行光纖陣列掃描技術(FAST)以檢測CTC中，將紅細胞溶解，并且將有核細胞在可容納多達3千萬個細胞的載玻片上分布為單層。該方法中無富集步驟。將細胞固定，透化處理，并用全(pan)抗細胞角蛋白抗體-Alexa?Fluor?555、CD45-Alexa?Fluor?647和DAPI(核染色)進行染色。FAST掃描各載玻片，并確定各紅色熒光物在載玻片上的位置。各熒光物通過自動數字顯微鏡成像，并且CTC作為CK+、CD45-、DAPI+細胞被計數。

CTC計數/表征的另一種方法是微流體或“CTC-芯片”技術。在這種方法中，全血流經78,000個EpCam涂覆的微柱。EpCam+細胞粘附至該柱，隨后用細胞角蛋白、CD45和DAPI染色。

利用上皮特異性標記如細胞角蛋白和EpCAM和/或組織特異性標記如PSA、PSMA、CDX2和TTF-1鑒定CTC的分析已在本領域中被述及。暴露(revealing)和檢測CTC的分析也已被述及在例如2009年9月3日提交的美國序號12/553,733中，在此引入作為參考。暴露樣品中的CTC包括去除、降解或改變聚集或物理結合于循環腫瘤細胞表面的蛋白質、碳水化合物、細胞或其組合以顯露細胞，從而暴露循環腫瘤細胞。暴露細胞可包括去除、降解或改變血漿蛋白、碳水化合物、血小板、其他血細胞或其組合。一般，血漿蛋白是凝血因子，如纖維蛋白。為顯露細胞，可以對細胞進行酶(例如，酶介導的生化反應)處理、機械(例如，機械力)處理、電(例如，電力)處理、電磁(例如，電磁波譜的電磁輻射)處理、化學處理或其任意組合。暴露的細胞可通過圖像分析和/或細胞表面標記的檢測被進一步分析。

在癌癥領域中，暴露、分離、檢測、鑒定和富集循環腫瘤細胞(CTC)的方法一直在發展。但是，隨著作出改進，需要利用越來越大量集合在一起的CTC信息的改進分析方法。因此，用于臨床、研究和發展定位(development?settings)的改進的有臨床意義的CTC分析方法以及癌癥治療的創新方法是有必要的。

發明概述

本發明提供利用多種細胞標記和暴露或非暴露分析對CTC進行分類的方法，其為癌癥患者的臨床分期和治療決策制定提供有益見解。

因此，一方面，本發明提供對來自對象的循環腫瘤細胞(CTC)進行分類的方法。該方法包括：a)提供來自對象的第一和第二樣品；b)暴露第一樣品中的CTC；c)利用對第一細胞標記特異的試劑分析第一樣品中暴露的CTC；d)利用對第一或第二細胞標記特異的試劑分析第二樣品中的CTC，其中第二樣品的CTC在分析前沒有被暴露或顯露；和e)比較c)和d)的結果以提供來自對象的CTC分類，從而對CTC進行分類。該方法可進一步包括將e)的結果與來自對象的CTC之前分類或與已知分類進行比較。