[發(fā)明專利]分子內(nèi)核酸重排的組合物和方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080037277.1
• 申請日: 2010-08-13
• 公開（公告）號: CN102482668A
• 公開（公告）日: 2012-05-30
• 發(fā)明（設計）人: S·布倫那;吉米卡瓦;R·奧斯本;A·斯拉特
• 申請（專利權）人: 群體遺傳學科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/66;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊帆

背景技術

我們已經(jīng)描述了標記片段化基因組群體內(nèi)各成員，然后將它們混合在一起產(chǎn)生能作為混合物進行加工和最終測序的‘群體文庫’的方法。群體標簽使得分析軟件能夠?qū)⑿蛄凶x數(shù)解析到歸為該群體中特定基因組的文件內(nèi)。總體方法的一個限制源于已有DNA測序技術的局限。具體說，如果基因組的感興趣區(qū)域中的片段比具體技術的可測序長度長，則無法完全分析這類片段(因為測序從片段的一端向內(nèi)進行)。而且，任何片段化依賴性測序技術的缺點是可能無法將特定基因組區(qū)域的一部分中的序列改變與同一基因組(例如同一染色體)的其它部分的序列改變相關聯(lián)，因為序列改變位于不同片段上。(參見圖5和其說明)。

本發(fā)明消除了現(xiàn)有測序技術造成的限制，并可用于多種其它核酸分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的諸多方面涉及相對于多核苷酸結構域?qū)⒃摱嗪塑账嶂械母信d趣區(qū)域從第一位置移動到第二位置的方法，也稱為“反射法”(或反射方法、反射序列法、反射反應等)。在某些實施方式中，所述反射法導致感興趣區(qū)域移動到與該多核苷酸內(nèi)特定結構域元件(如引物位點和/或MID)功能性相鄰。還提供可用于實施本文所述反射法的組合物、試劑盒和系統(tǒng)。

附圖簡要說明

結合附圖，通過以下詳述更好地理解本發(fā)明。需要強調(diào)，按照慣例，附圖的各個特征不成比例。事實上，各種特征的尺寸被任意放大或者縮小以清楚顯示。附圖包括以下圖1-13：

圖1：圖A的示意圖說明用反射序列將第一結構域從核酸分子中的一個位點移動到另一個位點。圖B的示意圖說明可用于本文所述反射方法的諸多方面的引物對(A_n-B_n引物)的相對位置。

圖2顯示采用結合對(生物素/鏈霉親和素)分離感興趣的單鏈多核苷酸的示范性實施方式。

圖3的示意圖說明將引物位點和MID移動到感興趣核酸中的具體位置的示范性實施方式。

圖4顯示的示意圖說明反射法用于產(chǎn)生富含具有感興趣區(qū)域的片段(例如，從隨機片段化和不對稱標記的多核苷酸群體富集)的樣品的示范性用途。

圖5顯示鑒定樣品中同源核酸(例如，衍生自二倍體細胞的染色體對或病毒基因組/轉(zhuǎn)錄物的同一區(qū)域)的核酸多態(tài)性的方法比較。上方示意圖顯示樣品中的兩種核酸分子(1和2)在多態(tài)性位點A、B和C處有不同多態(tài)性分配(A1、B1、C1和C2)。利用片段化進行的標準測序方法(左側)可鑒定這些核酸中的多態(tài)性，但不保留連接信息。利用本文所述的反射方法鑒定多態(tài)性(右側)能保留連接信息。

圖6：圖A示意顯示反射法中核酸物質(zhì)的預計結構和大小；圖B是聚丙烯酰胺凝膠，顯示實施例1所述反射法產(chǎn)生的核酸物質(zhì)。

圖7：圖A示意顯示反射法所用的核酸和競爭劑的結構；圖B是聚丙烯酰胺凝膠，顯示實施例1所述反射法產(chǎn)生的核酸物質(zhì)。

圖8顯示反射法流程圖(左圖)，其中T7外切核酸酶步驟是任選的。右側凝膠顯示沒有T7外切核酸酶步驟(泳道1)或有T7外切核酸酶步驟(泳道2)時反射法所得的產(chǎn)物。

圖9顯示示范性反射法流程，右側指出何時純化反應產(chǎn)物(例如，采用Agencourt珠去除引物寡核苷酸)。

圖10顯示原料(左圖)和采用反射法而不使用T7外切核酸酶步驟獲得的產(chǎn)物(右圖)(如實施例II所述)。原料中的反射位點是通常存在于所加工的多核苷酸中的序列(也稱為“非人工”反射位點)。此圖顯示，755堿基對原料核酸被加工成預計的461堿基對產(chǎn)物，從而確認“非人工”反射位點能有效地將銜接子結構域以序列特異性方式從感興趣多核苷酸中的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置。

圖11顯示實驗示意圖和結果，該實驗在單一較大初始模板(“親本”片段)上進行反射法以產(chǎn)生各自具有不同感興趣區(qū)域的五種不同產(chǎn)物(“子代”產(chǎn)物)(即產(chǎn)生的各子代產(chǎn)物具有區(qū)域1、2、3、4或5)。

圖12顯示實驗示意圖和結果，該實驗用于確定反射法(正如所需)期間的分子內(nèi)重排相對分子間重排(MID交換)的普遍性。

圖13顯示制備反射法所用材料和進行反射法的示范性流程圖。

定義

除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。但為了清楚和易于理解，仍然定義了某些要素。